Comportement des CSM pulvérisées dans un système à une couche

1. Répartition des cellules dans l'hydrogel

L'actine des cellules a été marquée avec de la phalloïdine-Alexa 488, puis observée par

microscopie confocale. Ce marquage a, tout d’abord, permis de visualiser l’ensemble des cellules à

l’intérieur de l'hydrogel. Ainsi, il apparaît, sur les figures 53A et 53B, une répartition homogène des

cellules au sein de l’hydrogel pulvérisé. Si certaines cellules se présentent de manière individuelle,

Points essentiels :

 la pulvérisation des chondrocytes ensemencés dans un gel

d'alginate n'est pas délétère pour les cellules,

 une pression de pulvérisation de 0,9 bar permet d'obtenir des

hydrogels d'une épaisseur satisfaisante,

 la résistance mécanique des hydrogels pulvérisés à 0,9 bar est

supérieure à celle des hydrogels moulés.

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des regroupements de deux ou plusieurs cellules sont également observés.

L’observation de l’actine au niveau des cellules montre une répartition plutôt périphérique

de ce constituant du cytosquelette (figures 53-C et 53-D).

Figure 53 : Répartition des cellules dans un hydrogel d'Alg/HA

Après 7 jours de culture, l'actine des CSM a été marquée avec de la phalloïdine-Alexa 488. Les CSM sont

distribuées de manière homogène dans l'hydrogel après leur pulvérisation (A-B). D'autre part, la répartition

de l'actine semble périphérique (A-B). Les images ont été obtenues par microscopie confocal (Leica

SP2AOBS, Objectif x40, ON = 0,8 (A à C) et objectif X10, ON = 0,3 (D)). Les barres d'échelles représentent 15

(A-B), 75 (C) et 300 µm (D).

2. Viabilité et activité métabolique

Les figures 54 et 55 représentent l'évolution de la viabilité cellulaire et de l'activité

métabolique des CSM ensemencées dans des hydrogels d'Alg/HA à une couche. La viabilité des

CSM est contrôlée, après 3, 14 et 28 jours de culture, en utilisant un kit Vybrant/Apoptosis^TM qui

permet de distinguer trois populations cellulaires : vivantes, nécrotiques et apoptotiques, par

cytométrie en flux.

Après 3 jours de culture, la viabilité est de 57,3 ± 3,9%. La proportion de cellules

apoptotiques est toujours inférieure à 1%, quel que soit le temps de culture. Le reste des cellules

mortes sont en nécrose. Au-delà de 7 jours (J7), la viabilité cellulaire augmente significativement

et ce jusqu'à la fin de la culture pour atteindre une viabilité supérieure à 90% (p>0,01 à J7, et

p<0,001 à J14, J21 et J28).

L'activité métabolique, représentée sur la figure 55, a été calculée grâce au pourcentage de

C D

B

A

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réduction de l'Alamar Blue rapporté à la quantité d'ADN dans un échantillon. Entre le 3^ème et le

7^ème jour de culture, l'activité métabolique des cellules est maintenue constante (p>0.05). A partir

de 14 jours de culture, l'activité métabolique tend à augmenter sans qu'aucune différence

significative ne soit observée par rapport à J3. Cette tendance devient significative à partir du

21^ème jour de culture (p<0,001 à J21 et J28).

Figure 54 : Evolution de la viabilité des CSM après leur pulvérisation

Après la construction par pulvérisation d'un hydrogel d'alginate/acide hyaluronique (Alg/HA) ensemencé de

CSM, la proportion de cellules vivantes a été évaluée par cytométrie en flux. Après 3 jours de culture, 57,2%

des cellules sont vivantes. Dès 7 jours de culture, la viabilité cellulaire augmente pour atteindre plus de 90%

au-delà de 14 jours. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM, N = 3, ** p <0,01, *** p <0,001 pour J3

vs Jx.

Figure 55 : Evolution de l'activité métabolique des CSM après leur pulvérisation

L'activité métabolique des CSM ensemencées dans un hydrogel d'Alg/HA pulvérisé a été calculée grâce au

pourcentage de réduction d'Alamar Blue rapporté à la quantité d'ADN. L'activité métabolique est stable

jusqu'à 14 jours de culture, puis elle augmente significativement après 21 et 28 jours de culture. Les

résultats sont exprimés en moyenne ± SEM, N = 3, *** p <0,001 pour J3 vs Jx.

3. Immununophénotypage des CSM au cours de la culture

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en flux. Il permet d’analyser la proportion de cellules exprimant un marqueur de surface

caractérisant les CSM. Ce test est réalisé sur les cellules en monocouche (à l’issue du 3^ème passage)

et sur les cellules ensemencées dans l’hydrogel d’Alg/HA.

a. Exclusion de certains marqueurs de surface

Sur la figure 56 sont représentés des histogrammes de fluorescence obtenus lors de

l’analyse des marqueurs de surface CD34, CD45 et HLA-DR. L’histogramme blanc représente

l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) obtenue lors de l’analyse du contrôle isotypique.

L’histogramme coloré représente l’IMF obtenue lors de l’analyse des échantillons cellulaires. La

superposition de ces deux histogrammes montre que les CSM n’expriment ni les marqueurs CD34

et CD45 (figure 56-A et 56-B) ni l’antigène HLA-DR (figure 56-C).

Figure 56 : Expression des marqueurs CD34 (A), CD45 (B) et HLA-DR (C) à la surface des CSM

L’histogramme blanc représente l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) obtenue lors de l’analyse du

contrôle isotypique (PE ou FITC). L’histogramme coloré représente l’IMF obtenue lors de l’analyse des

échantillons cellulaires.

b. Expression des marqueurs de surface en monocouche et en structure

tridimensionnelle

La figure 57 représente la proportion de cellules exprimant les marqueurs CD44 (figure

57-A), CD73 (figure 57-B), CD90 (figure 57-C), CD105 (figure 57-D) et CD166 (figure 57-E) à l’issue de la

culture en monocouche (P3) ou en structure tridimensionnelle (après 3, 14 et 28 jours de culture).

Il apparaît que l’expression du marqueur CD105 et CD166 diminue, de manière significative,

lorsque les cellules sont cultivées dans une matrice tridimensionnelle par rapport à la culture en

monocouche (figure 57-D et -E). En revanche, la proportion de cellules exprimant le marqueur

CD44 augmente significativement en culture tridimensionnelle par rapport à la culture en

monocouche (figure 57-A).

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cellules exprimant les marqueurs CD44, CD73 et CD90 est restée constante (figure 57-A, B et C).

Figure 57 : Evolution du phénotype de CSM ensemencées dans un hydrogel d'Alg/HA

Avant et après leur ensemencement, le phénotype des cellules souches mésenchymateuses a été étudié

après un immunomarquage des clusters de différenciation (CD) 44 (A), 73 (B), 90 (C), 105 (D) et 166 (E). Le

pourcentage de cellules positives est représenté en fonction du temps de culture pour chacun des CD, J0

étant les cellules en monocouches à la fin de la P3. L'expression de CD44 et CD105 est différentes

significativement entre la culture en monocouche des cellules, et leur culture dans un hydrogel d'Alg/HA à

J3. L'évolution des cellules positives par rapport au 3^ème jour de culture ne montre aucune différence

significative. Le pourcentage de cellules positives n'évolue pas pour CD44, 73 et 90. Quant à CD105 et

CD166, le nombre de cellules positives semble diminuer au cours du temps. Les résultats sont exprimés en

moyenne ± SEM, N = 3, * p<0,05, **p<0,01 pour J0 vs Jx.

4. Expression des gènes d'intérêt

Les figures 58 et 59 représentent l'évolution de l'expression génique de facteurs de

transcription et de protéines matricielles par des CSM ensemencées dans un hydrogel d'Alg/HA

pulvérisé et cultivées dans un milieu chondrogénique sans facteur de croissance.

L'expression génique est rapportée à celle de RP29 pour obtenir l'expression relative de

chaque gène.

Les expressions relatives de Sox9, COMP, Col1 et Agg augmentent significativement au cours

de la culture des CSM (p<0,01 pour Sox9 et p<0,001 pour Col1, Agg et COMP). D'autres gènes

comme Runx2 et Col10 sont exprimés tout au long de la cinétique, mais sans variation significative

de leur expression relative (p>0.05). Par ailleurs, l'expression génique de l'ostéocalcine (OC), du

versican et du collagène 2 total (Col2 total) augmente jusqu'à 14 jours de culture, puis stagne.

Enfin, l'expression relative de Col2A semble diminuer jusqu'à 28 jours de culture, mais pas de

manière significative.

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Figure 58 : Evolution de l'expression génique de facteur de transcription

L'expression génique de facteurs de transcription spécifique de la chondrogenèse et de l'ostéogenèse, Sox9

et de Runx2, a été reportée à celle de RP29 et analysée au cours de la culture des CSM dans un hydrogel

d'Alg/HA. Après 28 jours de culture, l'expression relative de Sox9 augmente significativement, alors que celle

de Runx2 est stable tout au long de l'étude. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM, N = 5, *** p

<0,001 pour J3 vs Jx.

Figure 59 : Evolution de l'expression génique de composants de la matrice extracellulaire

Pendant 28 jours, l'expression génique de composants de la matrice extracellulaire a été évaluée : les

collagènes de type I, II total, IIA, X (Col1, Col2 total, Col2A, Col10), la protéine core de l'aggrécanne (Agg), le

versican, la COMP, l'ostéocalcine (OC). Les expressions géniques de Col2 total, de Versican, Col10 et OC

semble être stable. Celles d'Agg, de COMP et de Col1 augmentent significativement au cours du temps.

Enfin, l'expression de Col2A semble diminuer au cours de la culture. Les résultats sont exprimés en moyenne

± SEM, N = 5, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 pour J3 vs Jx.

Dans le document Conception d'un hydrogel stratifié : application pour l'ingénierie du cartilage (Page 120-125)