INTRODUCTION
/HVDQWLFRUSVFRQMXJXpV $'&V UHSUpVHQWHQWO¶XQHGHVFODVVHVGHPROpFXOHV
thérapeutiques les plus prometteuses pour le traitement du cancer [1]. Ces
ELRPROpFXOHV FRPELQHQW OD VSpFLILFLWp G¶XQ DQWLFRUSV PRQRFORQDO P$E DYHF OD
présence de puissantes molécules cytotoxiques liées de façon covalentes au mAb par
le biais de linkers. Les cellules cancéreuses sont alors sélectivement détruites tout en
limitant les effets secondaires.
&HV SURWpLQHV VRQW GHV PDFURPROpFXOHV G¶HQYLURQ N'D HQYLURQ
acides aminés) qui peuvent générer des milliers de variants différents (charges, taille,
R[\GDWLRQ GHDPLGDWLRQ JO\FRV\ODWLRQ« [2]. Le nombre moyen de molécules
cytotoxiques conjuguées sur un mAb (DAR moyen) est également une donnée
majHXUHSXLVTX¶LOLQIOXHQFHOHVSDUDPqWUHVSKDUPDFRFLQpWLTXHVWR[LFRORJLTXHVPDLV
DXVVLODGLVVLSDWLRQHWO¶LQGH[WKpUDSHXWLTXHGHO¶$'&GDQVO¶RUJDQLVPH[3±5].
La complexité de telles structures requiert de multiples approches analytiques
complémentaires pour leur caractérisation telles que la chromatographie (IEX, SEC,
HIC, HILIC, RPLC), les techniques électrophorétiques (CZE, cIEF, CGE) et la
spectrométrie de masse (MS native, approches top-down, middle-up, bottom-up,
SHSWLGH PDSSLQJ« [6]. La possibilité de coupler ces techniques en ligne,
particulièrement en mode « comprehensive », présente donc un intérêt indéniable
SXLVTX¶LOVHUDSRVVLble de recueillir des données orthogonales en une seule injection
WRXWHQOLPLWDQWODFRQVRPPDWLRQG¶pFKDQWLOORQRXGHVSUREOqPHVGHFRQWDPLQDWLRQV
[7] /H GpYHORSSHPHQW HW O¶RSWLPLVDWLRQ GH WHOOHV PpWKodes bidimensionnelles
représentent toutefois un challenge analytique important aussi bien du point de vue
instrumental que du traitement des données.
/D VHFWLRQ $ GH FH FKDSLWUH GpWDLOOH VRXV OD IRUPH G¶XQ DUWLFOH O¶LQWpUrW HW
O¶RSWLPLVDWLRQG¶XQHPpWKode HICxRPLC-8906HQOLJQHSRXUODFDUDFWpULVDWLRQG¶XQ
ADC commercial à cystéine, le Brentuximab Vedotin (Adcetris©).
La section B est dédiée au traitement des données UV et MS de la méthode
GpYHORSSpH GDQV OD VHFWLRQ $ GDQV OH EXW G¶REWHQLU j OD IRLV Oe DAR moyen (i.e. le
nombre moyen de molécules cytotoxiques liées au mAb) ainsi que des informations
VWUXFWXUDOHV VXU O¶$'& /¶DQDO\VH G¶pFKDQWLOORQV G¶$'&V VWUHVVpV D pJDOHPHQW pWp
UpDOLVpHDILQG¶pWXGLHUODGpJUDGDWLRQGHFHVELRPROpFXOHV&HWWHSDUWLHHst présentée
VRXVODIRUPHG¶XQVHFRQGDUWLFOH
A. OPTIMISATION DES CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES
Article 4
³$QDO\VLV RI DQWLERG\-drug conjugates by comprehensive on-line
two-dimensional hydrophobic interaction chromatography x reversed phase liquid
chromatography hyphenated to high resolution mass spectrometry. I- Optimization of
FKURPDWRJUDSKLFFRQGLWLRQV´
M. Sarrut, A. Corgier, S. Fekete, D. Guillarme, D. Lascoux, M-C. Janin-Bussat,
A. Beck, S. Heinisch, J. Chromatogr. B, 1032 (2016), 103-111
JournalofChromatographyB,1032(2016)103–111
ContentslistsavailableatScienceDirect
JournalofChromatography B
j o ur na l h o me pa g e :w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / c h r o m b
Analysisof antibody-drugconjugates bycomprehensive on-line
two-dimensionalhydrophobicinteractionchromatographyx
reversed phaseliquidchromatographyhyphenated tohighresolution
massspectrometry.I −Optimization ofseparationconditions
MorganSarrut
a,AmélieCorgier
a,SzabolcsFekete
b,DavyGuillarme
b,DavidLascoux
d,
Marie-ClaireJanin-Bussat
c,AlainBeck
c,SabineHeinisch
a,∗aUnivLyon,CNRS,UniversitéClaudeBernardLyon1,EnsdeLyon,InstitutdesSciencesAnalytiques,UMR5280,5ruedelaDoua,F-69100VILLEURBANNE, France
bSchoolofPharmaceuticalSciences,UniversityofGeneva,UniversityofLausanne,Bdd’Yvoy20,1211Geneva4,Switzerland
cCenterofImmunologyPierreFabre,5AvenueNapoléonIII,BP60497,74160Saint-Julien-en-Genevois,France
dWatersSAS,BP608,78056StQuentinenYvelines,France
a r t i c l e i n f o
Articlehistory:
Received15January2016
Receivedinrevisedform19May2016 Accepted27June2016
Availableonline28June2016 Keywords: On-linecomprehensive2D-LC HICxRPLC-QTOF-MS Antibody-drugconjugate ADC Brentuximabvedotin Adcetris®
a b s t r a c t
Antibody-drug-conjugates(ADCs)manufacturingleadstoamixtureofspecieswhichneedstobe char-acterizedduringdevelopmentandforfurtherqualitycontrol.Thecouplingofon-lineHICxRPLCto highresolutionmassspectrometrycanbeconsideredasaveryefficientanalyticalmethod,providing extensiveinformationonADCsample,withinareducedtimescale.Ourintentioninthisfirstpaperisto presenttheapproachusedtorationallyoptimizethenumerousconditionsthatcanaffectthequalityof the2D-separation.HICandRPLCconditionswerethereforeoptimizedtopreventsaltprecipitationdueto solventmixingandtoenhancesensitivity,whilelimitingthetotalanalysistime.Wedemonstratedthat addingsaltinthesamplesolventbeforeHICinjectionallowsasignificantpeakshapeimprovement.The gradientprofilewasalsocarefullyoptimizedinbothdimensions,leadingtoatwo-stepgradientinHIC andbracketedgradientinRPLC.Thisstudyshowsthaton-lineHICxRPLChyphenatedtohighresolution massspectrometryisausefulmethodtoobtainrapidandextensivestructuralinformationonthepeaks observedinthefirstHICdimension,therebyleading,inasinglesteprequiring75min,totheprecise determinationoftheaveragedrug-to-antibodyratio(DAR)byHICaswellastheknowledgeofthedrug loaddistributionforaparticularDAR.ThestructuralcharacterizationofADCfragmentsbyRPLC-QTOF willbediscussedinthesecondpartofthistwo-partseries.
©2016ElsevierB.V.Allrightsreserved.
1. Introduction
Monoclonalantibodies(mAbs)andtheirrelatedproductssuch as antibody-drug-conjugates (ADCs), bispecific antibodies, Fab fragments,Fc-fusionproteinsandradio-immunoconjugatesarethe fastestgrowingclassofhumantherapeutics[1].Evenif numer-ousmAbsandderivativeshavebeenapproved,thefirstgeneration mAbsoftensuffersfromalimitedefficacy.ADCtechnology com-binesthespecificityofamonoclonalantibody(mAb)togetherwith apotentcytotoxicdrugcovalentlyboundedviaalinkertothe anti-body,allowinganefficacyimprovement.Therearetwomaintypes
∗ Correspondingauthor.
E-mailaddress:sabine.heinisch@univ-lyon1.fr(S.Heinisch).
ofADCtechnologybasedeitheroncysteineorlysinelinked conju-gationsandcurrently−asathirdclass−theso-calledengineered ADCs(cysteineresiduesareengineeredonthesurfaceofthemAb) areoftenmentionedasapromisingtechnology. Cysteinelinked ADCsaremadebythechemicalconjugationofcytotoxinstomAbs, byfirstreducinginter-chaindisulfidebonds,followedbythe con-jugationoftheresultingfreethiolswithdrugs.Thisprocessyields a controlled,but heterogeneouspopulationof conjugated prod-uctsthatcontainsspecieswithvariousnumbersofdrugslinkedto differentformerinter-chaindisulfidecysteineresiduesonthe anti-bodies[2].Thisprocessresultsinconjugateswithadistributionof 0,2,4,6and8drugsincorporatedperantibodyandanaverage DARofaround3–4drugs/mAbwhichseemstobeoptimalin clini-caltrials[3,4].Fig.1showsthepossiblepositionalisomersofDAR speciesofacysteineconjugatedADC.InADCproducts,theDAR0 http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2016.06.048
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