I. INTRODUCTION
1.2 R ÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION
1.2.1 Les complexes Rb /E2F
a) Les protéines de la famille RB
® Fonction
Le gène du Rétinoblastome (Rb) fut le premier gène suppresseur de tumeur identifié (Knudson, 1978). Il fut isolé à partir de tumeurs d’enfants atteints d’une maladie rare, le Rétinoblastome. Les mutations affectant le gène du Rétinoblastome sont fréquentes, non seulement dans le Rétinoblastome, mais aussi dans d’autres types de cancers comme l’ostéosarcome, le cancer du sein ou le cancer de la prostate (Classon and Harlow, 2002). Son rôle fondamental de gène suppresseur de tumeur s’illustre également par le fait que la protéine pRb peut être fonctionnellement inactivée par hyperphosphorylation constitutive dans des tumeurs ne présentant pas de mutations du gène (Sherr, 1996). De plus, les oncoprotéines virales impliquées dans la transformation cellulaire comme E1A de l’adénovirus, l’antigène T de SV40 et E7 du papillomavirus HPV-16, se lient et inactivent pRb (Classon and Harlow, 2002!; Munger and Howley, 2002).
La protéine pRb joue un rôle essentiel dans la régulation du cycle cellulaire, et notamment son expression conduit à un arrêt en phase G1 (Weinberg, 1995). Sa fonction dépend en partie de son interaction avec les facteurs de transcription de la famille des E2F (Dyson, 1998!; Harbour and Dean, 2000b). Les sites E2F sont présents dans les promoteurs de nombreux gènes dont les produits sont importants dans la progression du cycle cellulaire, et pRb réprime la transcription de ces gènes à travers ses interactions avec les E2F (Dyson, 1998!; Harbour and Dean, 2000b).
pRb appartient à une famille de protéines appelées les "pocket proteins". Cette famille comprend également les protéines p107 et p130 qui partagent certaines propriétés biologiques. Entre autres, elles se lient aux oncoprotéines virales, aux facteurs E2F et inhibent l’activation transcriptionnelle de gènes sous contrôle des E2F (Dyson, 1998!; Harbour and Dean, 2000c). Leur expression forcée induit comme pour pRb, à un arrêt de la croissance cellulaire (Claudio et al., 1994). Cependant, il existe des différences significatives entre les protéines de la famille de pRb. Par exemple, elles se lient à des protéines différentes et en
particulier à des membres différents de la famille des E2F in vivo (Harbour and Dean, 2000b!; Mulligan and Jacks, 1998; Nevins, 1998!). De plus, elles ont des cinétiques d’association avec les E2F, spécifiques, qui dépendent des phases du cycle cellulaire!: p130 prédomine dans les cellules quiescentes, p107 se lie majoritairement aux E2F en phase S où elle est fortement exprimée et pRb se fixe aux E2F dans les cellules quiescentes et en prolifération (Nevins, 1998). L’analyse de souris déficientes pour p130, p107 ou pRb montre également que ces protéines ont des rôles distincts. Tandis que pRb est essentielle au développement embryonnaire, l’absence de p130 ou p107 dans des souris de même fonds génétique, n’a aucune conséquence sur la viabilité des souris. Par contre, les souris déficientes pour p107 et p130 ne sont pas viables. Ces résultats suggèrent que p107 et p130 ont des fonctions biologiques redondantes alors que pRb possède des fonctions biologiques uniques (Mulligan and Jacks, 1998). De plus, la perte de p130 et p107, contrairement à celle de pRb, n’augmente pas l’incidence tumorale. Cette dernière observation et l’absence de mutation de p107 et p130 dans les tumeurs humaines indiquent que contrairement à pRb, p130 et p107 ne sont pas des suppresseurs de tumeurs (Mulligan and Jacks, 1998).
® Structure
Les protéines de la famille de pRb contiennent plusieurs domaines fonctionnels (figure 18). Les domaines A et B sont hautement conservés, ils interagissent pour former la poche centrale, d’où le nom de "pocket" protéines. Ces domaines sont critiques pour la fonction de suppresseur de tumeur de pRb. En effet, la plupart des mutations de pRb entraînent la destruction de cette poche. Le domaine B permet la fixation de protéines renfermant un motif LXCXE, présent dans les oncoprotéines virales et les histones déacétylases (figure 18 et introduction 1.2.3). Les E2F ne possèdent pas de motif LXCXE, elles se lient aux "pocket" protéines par un site distinct qui implique plusieurs points de contact dans la poche et la partie carboxyterminale. Ceci permet aux E2F de recruter sur les promoteurs des complexes formés de pRb et d’autres protéines, qui ont un motif LXCXE.
® Inactivation des protéines de la famille pRb par phosphorylation
La fonction des "pocket" protéines est régulée par phosphorylation au cours du cycle cellulaire (figure 18). La forme hyperphosphorylée (inactive) prédomine dans les cellules en prolifération, tandis que la forme hypophosphorylée (active) est abondante dans les cellules quiescentes ou différenciées. Les principales kinases impliquées dans la phosphorylation des "pocket" protéines sont les Cdk. pRb est le substrat de Cdk4, Cdk6, Cdk2 et Cdk1. Lors de la
progression dans le cycle cellulaire, l’activation ordonnée des Cdk mène à une phosphorylation séquentielle des "pocket" protéines. La phosphorylation inactive les «!pocket!» protéines, entraînant la dissociation des complexes Rb/E2F et donc permettant l’expression des gènes régulés par les E2F (Harbour et al., 1999). Cependant, pour p130, le mécanisme d’inactivation est un peu différent. En effet, p130 est majoritairement phosphorylée par le complexe Cycline D/Cdk4 en début de phase G1, ce qui induit sa dégradation par le protéasome et donc contribue à l’activation des gènes réprimés par p130/E2F (Tedesco et al., 2002).
b) Les facteurs de transcription de la famille des E2F
® Fonction
La famille des E2F contient 6 membres (E2F1-6) qui diffèrent selon leur propriété transcriptionnelle et leur interaction potentielle avec les "pocket" protéines (Stevaux and Dyson, 2002) (figure 19). E2F 1, 2 et 3 sont considérés comme des activateurs de la transcription, alors que E2F4, 5 et 6 fonctionnent comme des répresseurs (Trimarchi and
Lees, 2002). pRb se lie préférentiellement à E2F1-3, bien qu’il s’associe aussi à E2F4. p130 s’associe principalement à E2F4 et E2F5, tandis que p107 s’associe uniquement avec E2F4. Enfin, E2F6 n’interagit pas avec les "pocket" protéines. Biologiquement, E2F1-3 sont nécessaires pour la progression dans le cycle cellulaire alors que E2F4-5 sont requis pour l'établissement de la quiescence et la différenciation terminale.
Selon le modèle actuel, il existerait deux types de complexes selon l’état de prolifération des cellules. Dans les cellules quiescentes, les promoteurs des gènes sous contrôle des E2F sont occupés exclusivement par les complexes E2F4/p130 réprimant la transcription. Par contre, lorsque les cellules entrent dans le cycle cellulaire et progressent en G1, les complexes E2F4/p130 sont remplacés par les activateurs E2F1-3 (Rayman et al., 2002!; Takahashi et al., 2000). Cependant, ce modèle ne fait pas l'unanimité et est très controversé. En effet, d’autres travaux indiquent que certains promoteurs ne suivraient effectivement pas ce modèle de régulation transcriptionelle relayée par les E2F (Wells et al., 2000). Il a donc été suggéré que plusieurs types de complexes pourraient se former sur un même promoteur et que la nature des complexes identifiés dépendrait entre autres, de la lignée cellulaire étudiée et de la technique de synchronisation des cellules (figure 19).
® Structure
Les facteurs de transcription de la famille E2F contiennent un domaine de liaison à l’ADN et un domaine d’activation de la transcription. Le domaine de fixation à l’ADN des E2F, seul, a une très faible affinité pour sa séquence consensus, par contre, les hétérodimères formés d’un membre des E2F et d’une protéine DP (Dimerisation Partner) s’y lient avec une forte affinité. Le domaine d’activation de la transcription contient le site de fixation pour les "pocket" protéines. Par conséquent, la fixation des "pocket" protéines sur les E2F inhibe directement la fonction transactivatrice des E2F.
® Les gènes cibles des E2F
Les gènes sous le contrôle des facteurs de transcription E2F/DP sont très nombreux et possèdent des rôles très variés comme la régulation du cycle cellulaire, la différenciation et la mort cellulaire programmée, l’apoptose (Ren et al., 2002!; Stevaux and Dyson, 2002). Les gènes cibles des E2F sont impliqués dans la plupart des phases du cycle cellulaire!: la transition G1/S, la réplication de l’ADN et la mitose. Cependant, ils jouent également un rôle important dans les mécanismes de surveillance, appelés points de contrôle (ou checkpoint) et dans les mécanismes de réparations de l’ADN (figure 20).