Les différents complexes protéiques à la base du cil

Des approches de co-immunoprécipitation et d’immuno-histochimie avaient montré l’association de différentes néphrocystines entre elles. Une étude récente a utilisé une technique de purification par affinité en tandem couplée à une approche protéomique de spectrométrie de masse, pour identifier le réseau d’interaction des protéines impliquées dans la NPH (NPHP), le syndrome de Joubert (JBTS) et le syndrome de Meckel (MKS). Dans ce crible, 850 partenaires des néphrocystines, de MKS1 et d'AHI1/Joubérine, ont été co-purifiés. En plus de l’analyse protéomique, leurs effets sur la ciliogenèse ou la morphogenèse épithéliale en culture 3D ont été testés dans des cellules IMCD3 et RPE1 (Retinal pigmented epithelial cell) invalidées pour les différents gènes. L'analyse de leurs résultats a mis en lumière un important réseau protéique et révélé l’existence de plusieurs modules distincts de protéines NPHP à la base du cil primaire : le module "NPHP1-NPHP4-RPGRIP1L" localisé à la TZ, le module

compartiment inversine et le module "MKS", lié à la voie de signalisation Hedgehog (Sang et al, 2011) (Figure 10).

Figure 9 : Structure protéique des néphrocystines et des IFTAs. Les néphrocystines et les IFTA

partagent de nombreux domaines protéiques permettant les interactions protéine-protéines et la formation de complexes macromoléculaires. Parmi ces domaines, le domaine coiled-coil (CC) permet l’oligomérisation des protéines, le domaine SH3 (pour Src Homology 3) reconnait et interagit avec les régions riches en prolines des protéines (séquence consensus : PxxP), le domaine C2 et le domaine

IQ sont des domaines liés à la signalisation calcique impliquée dans de différents processus

cellulaires. Des motifs répétés sont présents dans les différentes protéines de la NPH : le domaine

tétratricopeptide (TPR) et le motif Ankyrine (ANK) sont important dans les interactions protéine-

protéine et l’assemblage de complexes multiprotéiques, les répétitions WD40 (WDR) sont souvent présentes dans des protéines impliquées dans des processus cellulaires variés (cycle cellulaire, apoptose, régulation des gènes), les domaines transmembranaires (TMEM) sont des structures protéiques tridimensionnelles thermodynamiquement stables à l’intérieur des membranes. ARM-like: répétition de motifs Armadillo. Adapté de (Garcia-Gonzalo et Reiter, 2012; Taschner et al, 2012)

- Le module NPHP1-NPHP4-RPGRIP1L à la TZ

L’association des protéines NPHP1-NPHP4-RPGRIP1L fut initialement décrit par notre équipe dans les cellules rénales suite à leur identification (Mollet et al, 2005 ; Delous et al, 2007). Ainsi, par des expériences de co-immunoprécipitation, il a été montré que la partie C-terminale de NPHP1 est requise pour interagir avec NPHP4 (Mollet et al, 2005). De plus, les mutations faux-sens T615P et T677I situé dans le domaine C2 de RPGRIP1L, identifiées chez les patients avec un syndrome de Joubert, diminuent l’interaction avec NPHP4 (Delous et al, 2007). Ceci suggère qu'un défaut d’interaction entre ces protéines pourrait participer à l’apparition des phénotypes chez les patients. Ceci, corrèle avec l’analyse fonctionnelle des simples et doubles mutants des orthologues de ces protéines chez C elegans. En effet, dans ce modèle il a été montré que RPGRIP1L est nécessaire à la localisation de NPHP4 à la zone de transition (TZ) des cils sensoriels des cellules neuronales. De plus, NPHP4 est lui-même requis à la localisation de NPHP1 à la zone de transition (Williams et al, 2008 et 2011 ; Wintelbauer et al, 2005). Chez C elegans, l’invalidation de ces gènes NPHP associée à l’invalidation de certains gènes MKS/JBTS, a été montré que les protéines NPHP1-NPHP4-RPGRIP1L participent à la stabilité de la TZ et à la localisation spécifique de composants ciliaires (Huang et al, 2011 ; Jauregui et al, 2008).

- Le compartiment inversine

Le compartiment inversine dont la fonction n'est pas clairement établie, se situe au niveau de la région proximale du cil juste au dessus de la zone de transition (Shiba et al, 2009) et sa longueur, d'à peu près 2 µm, est définie par le pattern d’expression de l’inversine indépendamment de la taille du cil. Présents au compartiment en plus de l’inversine, on retrouve NPHP3 et NEK8/NPHP9 (Shiba et al, 2010; Sang et al, 2011). Cependant, la perte de l’inversine dans ce compartiment aboutit à une délocalisation de ses partenaires NPHP3 et NEK8 au cil, suggérant que l’inversine sert d’ancrage moléculaire pour ces deux protéines (Shiba et al, 2010). De façon intéressante, les rares cas de défauts cardiaques et de situs inversus associés à la NPH ont été décrits chez des patients mutés pour INVS et

NPHP3 et les souris invalidées pour ces gènes (Bergman et al, 2008; Otto et al, 2003) (Tableau 2

p.47). Par ailleurs, une mutation faux sens (G448V) du gène Nek8 dans la souris jck située dans le domaine RCC1 de la protéine (Figure 9), entraine une maladie kystique rénale (Liu et al, 2002 et Tableau 2 p.47). Dans les cellules IMCD, l'étude de l'expression des protéines possédant les trois mutations du gène NEK8 retrouvées chez les patients NPH, montre des défauts de localisation de NEK8 au centrosome et au cil primaire (Otto et al, 2008). De plus, NEK8 interagit et régule l'expression et la phosphorylation de la polycystine-2 (Sohara et al, 2008) suggérant un rôle de Nek8 dans la signalisation ciliaire.

- Le complexe JBTS/MKS

En plus des néphrocystines, la zone de transition se compose des protéines impliquées dans le syndrome de Joubert (JBTS) et le syndrome de Meckel (MKS). Par des approches protéomiques de purification par affinité en tandem et de spectrométrie de masse, deux autres études ont identifié les autres composants de la zone de transition. Ainsi, plus de 150 partenaires potentiels de Tectonic1, protéine codée par un gène muté chez des patients avec un syndrome de Joubert, ont été co-purifiés dans les cellules NIH3T3, notamment les protéines CEP290 et TMEM67 (Garcia-Gonzalo et al, 2011). La seconde étude réalisée dans les cellules IMCD3 a mis en évidence un complexe plus restreint de neuf protéines de la TZ (B9D1, B9D2, Tectonic 1 et 2 (TCTN1 et 2), MKS1, AHI1, CC2D2A, TMEM231, TMEM17), elles aussi codées par des gènes mutés chez des patients présentant des syndromes JBTS ou MKS (Chih et al, 2012). De façon intéressante, RPGRIP1L (Williams et al, 2011), inversine (Sang et al, 2011) et CEP290 (Garcia-Gonzalo et al, 2011) sont co-purifiés à la fois avec les protéines du complexe NPHP et du complexe MKS/JBTS, suggérant un lien étroit entre ces complexes à la TZ.