HaWLIM-1 au cours de la culture.
La quantification de l’expression d’un gène est difficile à réaliser par la technique classique de RT-PCR. Variations dans la quantité réelle d’ADN initial, dans le déroulement de la réaction de PCR, sont autant de facteurs qui peuvent modifier l’intensité de l’amplification d’un échantillon à un autre, et donc l’intensité du marquage sur le gel d’agarose. Il est donc délicat de comparer directement sur le gel les différences d’intensité existant entre différents échantillons.
La technique généralement utilisée pour quantifier de façon précise l’expression d’un gène est une analyse par hybridation de type Northern utilisant la comparaison avec un témoin interne stable, généralement les ARNr 28S. Cependant, les quantités relatives en ARNm correspondant au gène HaWLIM-1 dans les différents tissus et organes de tournesol sont si faibles que la détection en Northern blot de ces ARN est très difficile (Mundel et al., 2000). Cette analyse n’a donc pas été réalisée sur les protoplastes.
Une autre technique permettant une approche quantitative de l’analyse de l’expression d’un gène est la RT-PCR comparative, ou semi-quantitative. Elle consiste à réaliser une amplification à l’aide d’amorces spécifiques du gène étudié, et d’amorces spécifiques d’un gène d’expression constitutive utilisé comme témoin interne. Cette amplification est menée à partir de quantité d’ADNc identiques, afin de pouvoir par la suite comparer l’intensité des signaux obtenus.
B1. Le choix d’un témoin d’expression constitutive.
Dans la littérature, on peut trouver plusieurs gènes couramment utilisés comme témoin d’expression constitutive en RT-PCR comparative, à savoir les gènes de l’actine, de la tubuline, de la calmoduline et de l’ubiquitine. Cependant, pour pouvoir disposer des amorces PCR correspondantes, il est nécessaire que ces gènes aient été précédemment clonés et séquencés chez la plante d’intérêt.
Pour réaliser la RT-PCR comparative sur les protoplastes d’hypocotyles de tournesol, la principale difficulté est de choisir le témoin interne le mieux adapté à ce matériel végétal. Parmi les gènes précédemment cités, seul le gène de la calmoduline a été séquencé chez le tournesol (Courbou et al., 1997). Le gène de l’actine n’a à ce jour pas été séquencé chez le tournesol, mais nous avions à notre disposition des amorces PCR spécifiques du gène de l’actine de poire capables de donner un produit d’amplification spécifique à partir d’ADNc de tournesol (V. Legrand – communication personnelle). Nous avons donc choisi deux témoins internes pour la réalisation des expériences de RT-PCR comparatives sur les protoplastes de tournesol : le gène de la calmoduline et le gène de l’actine.
B2. La stratégie retenue pour l’amplification.
Pour pouvoir comparer l’intensité de l’amplification entre le gène d’intérêt et le gène témoin, il est indispensable de réaliser les deux réactions PCR différentes à partir de quantité d’ADNc rigoureusement identiques. La méthode la plus fiable consiste à réaliser les deux amplifications simultanément sur une matrice d’ADNc unique. Il est cependant nécessaire dans ce cas que les deux couples d’amorces utilisés (amorces spécifiques du
gène d’intérêt et amorces spécifique du gène témoin) conduisent à l’obtention de deux produits d’amplification de taille distincte, pouvant être individualisés lors de l’électrophorèse.
Les amorces PCR dont nous disposons pour ces expériences conduisent à l’obtention de produits d’amplification de taille théorique égale à 565 pb pour le gène HaWLIM-1, 443 pb pour le gène de la calmoduline, et 535 pb pour le gène de l’actine. Les amorces spécifiques du gène HaWLIM-1 et du gène de la calmoduline, conduisant à des produits d’amplification de taille suffisamment différente, peuvent donc être utilisées simultanément.
B3. L’expression du gène HaWLIM-1 semble diminuer au cours de la culture des protoplastes.
La réaction d’amplification par PCR est réalisée sur des premiers brins d’ADNc issus de protoplastes d’hypocotyles de tournesol, soit en utilisant simultanément sur une même matrice d’ADNc les amorces spécifiques du gène HaWLIM-1 et les amorces spécifiques du gène de la calmoduline (Fig. 33-A), soit en utilisant séparément les amorces spécifiques du gène HaWLIM-1 et du gène de l’actine sur des quantités équivalentes d’ADNc (Fig. 33-B). Pour chaque durée de culture, l’intensité du signal obtenu pour le gène HaWLIM-1 est comparée à l’intensité du signal obtenu pour le gène témoin, puis le rapport entre les deux intensités est calculé ( pour plus de précisions sur la détermination de ce rapport, se reporter au chapitre « Matériels et Méthodes »).
Sur la figure 33, on peut voir que, au tout début de la culture des protoplastes, l’expression du gène HaWLIM-1 est assez importante. Si on observe de façon globale l’ensemble des résultats, il semble que l’expression du gène HaWLIM-1 diminue au cours du temps. Cependant, les résultats obtenus avec les deux stratégies d’amplification sont contradictoires, puisque lorsqu’on utilise le gène de la calmoduline comme témoin interne, on peut noter une augmentation transitoire et importante de l’expression du gène HaWLIM-1 au sixième jour de culture, alors que cette augmentation est absente dans le cas de l’utilisation du gène de l’actine.
B4. Comment optimiser la technique de RT-PCR comparative ?
Ces observations doivent donc être considérées uniquement comme une approche préliminaire de l’étude du niveau d’expression du gène HaWLIM-1 au cours de la culture des protoplastes. En effet, trop d’incertitudes persistent encore quant à la fiabilité de la technique de RT-PCR comparative telle qu’elle a été utilisée dans ces expériences.
Le choix d’un témoin interne d’expression constitutive chez les protoplastes de tournesol pose certains problèmes. A l’heure actuelle, seul le gène de la calmoduline est séquencé chez le tournesol, ce qui permet de choisir et d’obtenir des amorces spécifiques parfaitement bien adaptées à l’expérimentation. Cependant, même si ce gène est considéré comme un bon témoin d’expression constitutive dans certaines conditions, son expression peut également être induite en cas de stress (Bergey et Ryan, 1999 ; Vian et al., 1996). Or les protoplastes sont des entités particulièrement fragiles et particulièrement exposées au moindre stress. L’utilisation du gène de la calmoduline comme témoin chez les protoplastes peut donc fausser les résultats obtenus. Le gène de l’actine semble constituer un témoin plus fiable, mais les amorces dont nous disposons à l’heure actuelle ne sont pas adaptée à une amplification simultanée.
Le fait que le gène de l’actine ne soit pas séquencé chez le tournesol ne nous permet pas de disposer d’un grand choix d’amorces susceptibles de conduire à l’amplification de ce gène à partir d’ADNc de protoplastes de tournesol.
Ce problème nécessite donc d’être levé avant de pouvoir étudier plus en détail l’évolution de l’expression du gène HaWLIM-1 au cours de la culture des protoplastes.