Comparaison des deux stratégies évaluées en termes de nombre de protéines

d’utiliser un gradient de 180 minutes pour les échantillons qui n’ont pas été décomplexifiés par gel SDS-Page dans le but de réduire le temps d’analyse global pour l’expérience complète.

B.2.4. Comparaison des deux stratégies évaluées en termes de nombre de protéines identifiées

Le nombre de protéines identifiées suite aux traitements avec ou sans fractionnement des échantillons (« Pool 1-Pool 5 ») est présenté en figure V-6.

Figure V-6 Nombre de protéines identifiées suite aux deux types de traitement des échantillons testés

Le nombre de protéines identifiées pour les échantillons dont le protocole de traitement a inclus une étape de préfractionnement par gel SDS-Page est deux fois supérieur à celui des échantillons non préfractionnés.

D’après la figure V-6, on constate que la décomplexification par gel SDS-Page permet de doubler, et ce de façon reproductible, le nombre de protéines identifiées par rapport à la stratégie sans préfractionnement. En termes de protéines identifiées, la stratégie par préfractionnement par gel est donc largement supérieure au traitement sans préfractionnement. En complément de ce résultat, une évaluation de la reproductibilité des intensités de courants d’ions générés pour chaque type de traitement a été réalisée.

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B.2.5. Comparaison des intensités des courants d’ions extraits pour les deux traitements d’échantillons en termes de reproductibilité

Le traitement des données effectué pour comparer les deux stratégies en termes de reproductibilité a été réalisé grâce au logiciel Skyline et correspond à la réalisation des étapes suivantes (décrites dans le chapitre « Stratégies d’analyses protéomiques quantitatives en page 68 ») :

1. les spectres issus des analyses nanoLC-MS/MS pour chaque type de traitement d’échantillons ont été soumis à l’algorithme de recherche Mascot. Les spectres dont l’assignation a été validée à moins de 1 % de résultats « faux-positifs » ont été regroupés pour former une librairie spectrale par type de traitement réalisé.

2. les courants d’ions de chaque peptide pour lequel un spectre est présent dans la librairie spectrale ont été extraits par le logiciel Skyline à partir des analyses nanoLC-MS/MS correspondantes à chaque type de traitement des échantillons.

La reproductibilité des intensités des courants d’ions a été évaluée pour 3416 protéines pour la stratégie basée sur le préfractionnement des échantillons par gel SDS-Page et 1991 protéines pour la stratégie sans préfractionnement (15199 et 7260 peptides respectivement). Un certain nombre de ces protéines et peptides sont communs aux deux stratégies de traitement comme le présente la figure V-7.

Figure V-7 Nombre de protéines et peptides identifiés pour chacune des stratégies de traitement des échantillons

50 % des protéines identifiés, et 30 % des peptides, sont communs aux deux types de traitement des échantillons.

On peut constater d’après ces résultats qu’en plus d’avoir permis d’identifier le double de protéines, le traitement par préfractionnement a permis d’identifier un nombre beaucoup plus important de

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peptides (10375 peptides ont été identifiés spécifiquement pour la stratégie avec préfractionnement contre 2436 pour la stratégie sans préfractionnement).

Afin de comparer les aires sous les courbes des courants d’ions intégrés, les coefficients de variations moyens des peptides ont été calculés pour chacun des traitements. Les données n’ont pas été normalisées pour cette comparaison.

• Avec préfractionnement (gel SDS-Page 6 bandes) : les aires sous la courbe des courants d’ions extraits pour P, P+1 et P+2 par état de charge et par peptide ont été sommées par piste (= 6 bandes). Les coefficients de variations ont été calculés d’après les 4 pistes analysées pour les tests (deux dépôts analysés deux fois)

• Sans préfractionnement : les aires sous la courbe des courants d’ions extraits P, P+1 et +2 ont été sommées par état de charge et par peptide. Les coefficients de variations ont été calculés d’après les 6 analyses réalisées pour les tests (deux analyses de chaque échantillon test préparé).

Les coefficients de variation de l’ensemble des peptides identifiés au sein de chacune des stratégies de préparation sont présentés en figure III-8 sous la forme de boite à moustaches. Les coefficients de variation de l’ensemble des peptides identifiés au sein de chacune des stratégies à l’exception des peptides contenant des méthionines ont été également représentés sur ce graphique. En effet, ces peptides sont sujets à des modifications post-traductionnelles (oxydation de la fonction thiol des méthionines) dont la proportion peut varier en fonction des étapes à réaliser et du temps de préparation des échantillons.

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Figure V-8 Boîtes à moustaches représentant les coefficients de variation de l’ensemble des peptides pour chaque type de traitement et ce même ensemble sans les peptides contenant des méthionines

Les coefficients de variation pour l’ensemble des peptides identifiés pour chacune des stratégies semblent équivalents, en revanche, les coefficients de variations sur ces mêmes ensembles de peptides à l’exception des peptides contenant des

méthionines sont très inférieurs pour la stratégie sans préfractionnement comparée à celle avec préfractionnement.

La figure V-8 permet de constater que la reproductibilité des courants d’ions intégrés pour l’ensemble des peptides identifiés semble équivalente pour les deux traitements d’échantillons (en gris sur la figure V-8). Les coefficients de variation obtenus pour chaque traitement sont compris entre 10 et 30 % environ. En revanche, une fois les peptides contenant des méthionines éliminés des données (en blanc sur la figure V-8), la stratégie sans préfractionnement apparait comme plus reproductible par rapport à la stratégie avec préfractionnement par gel SDS-Page. On peut donc conclure de cette figure que les peptides contenant des méthionines sont effectivement sujets à un manque de reproductibilité et qu’ils étaient responsables de l’importante dispersion des coefficients de variation observée pour l’ensemble des peptides à l’issue du traitement sans préfractionnement. Ces résultats suggèrent la présence de multiples formes modifiées pour les peptides contenant des méthionines. Ce phénomène peut s’expliquer par l’étape critique d’extraction et de concentration sur cartouche C18 qui n’est réalisée que pour cette stratégie. En revanche, on peut constater que l’importante dispersion des coefficients de variation obtenus à l’issue du traitement avec préfractionnement n’est pas impactée par l’absence de ces peptides et que le manque de reproductibilité est propre au préfractionnement lui-même.

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Nous avons ensuite réalisé la comparaison des peptides communs aux deux stratégies de traitement des échantillons (à l’exception de ceux contenant des méthionines), soit 3198 peptides (figure V-9).

Figure V-9 Histogrammes présentant les coefficients de variation obtenus à partir de l’extraction des courants d’ions de tous les peptides identifiés (à l’exception des peptides contenant des méthionines) pour les deux stratégies

La figure V-9 permet de constater que la stratégie sans préfractionnement présente une reproductibilité plus élevée que la stratégie par gel pour l’ensemble des peptides communs (à l’exception de ceux qui contiennent des méthionines qui n’ont pas été comparés ici). En effet, sur 3198 peptides analysés communs aux deux types de traitement des échantillons, le coefficient de variation moyen des aires des peptides issus des échantillons préfractionnés est d’environ 20 % tandis que ceux issus de la stratégie sans préfractionnement présentent un coefficient moyen de 12 % environ. Près de 90 % des peptides communs possèdent un coefficient de variation inférieur à 20 % pour la stratégie sans préfractionnement, dont plus de la moitié inférieur à 10% comme le montre les histogrammes présentés en figure V-9. Près de 70% des peptides communs possèdent un coefficient de variation inférieur à 20% pour la stratégie avec préfractionnement, et seulement environ 40 % ont un coefficient de variation inférieur à 10 %. De ce fait, sur l’ensemble des peptides communs (à l’exclusion de ceux contenant des méthionines), la stratégie sans préfractionnement présente une reproductibilité largement supérieure à la stratégie avec préfractionnement.

Avec préfractionnement par gel Sans préfractionnement Coefficient de variation moyen (%) 18% 12% Nb de peptides coefficient de variation ≤20% 2119/3198 soit 66% 2669/3198 soit 84% 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 10 20 30 40 50 60 N o m b re d e p e p ti d e s Coefficient de variation (%) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 10 20 30 40 50 60 N o m b re d e p e p ti d e s Coefficient de variation (%) Avec préfractionnement par gel Sans préfractionnement

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