c. Comparaison des profils transcriptionnels après exposition à H. pylori

Les résultats de RT-QPCR et dosages ELISA présentés correspondent à des analyses réalisées sur des cultures primaires de CEGHA issues de 3 sujets H. pylori-négatifs:

Patient A Homme, 63 ans Patient C, Femme, 35 ans Patient D, Femme, 26 ans

Le patient B, (omme de ans, a été exclu de cette étude puisqu’il était H. pylori-positif.

Une induction cagM et dose-dépendante en début d’infection

L’analyse de l’expression d’un panel de gènes codant des médiateurs inflammatoires et peptides antimicrobiens après 3h de stimulation des CEGHA avec H.°pylori a été réalisée par RT-PCR quantitative. Les gènes analysés sont ceux codant pour

l’)L-8, le CXCL1, le CXCL2, le CXCL , le CXCL , l’)L-6, le TNF- , l’)L - , le COX , le CCL , le S100A7, le S100A8, le S100A9, la hBD1, la hBD2 et la hBD3.

La stimulation des CEGHA avec la souche de H. pylori B128 pendant 3h induit de manière dose-dépendante l'expression relative des ARNm codant pour les médiateurs inflammatoires IL-8, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CCL20 et TNF- par rapport aux contrôles non stimulés (Figure 27). Lors de la stimulation par la souche B128 à la dose infectieuse de bactéries/cellule, l’expression des ARNm codant pour CCL20 est environ fois plus élevée, fois plus élevée pour l’)L-8, TNF- , CXCL , CXCL et fois plus élevée pour CXCL2 et CXCL5 par rapport à la dose infectieuse de 10 bactéries/cellule de la même souche. La variation de l’expression relative du transcrit codant pour COX2 est négligeable et aucune expression de l’ARNm codant l’)L- ou l’)L- n’a été observée. L’expression des ARNm codant les cytokines et chimiokines proinflammatoires IL-8, TNF , CXCL , CXCL , CXCL , CXCL et CCL par par les CEGHA stimulées avec la souche B128ΔcagM est environ doublée à la dose infectieuse de 100 bactéries/cellule par rapport à la dose de bactéries/cellule Figure . L’expression des médiateurs cités ci-dessus est cagM-dépendante puisqu’ils sont tous plus fortement induits par la souche B128 que par son mutant isogénique indépendamment de la dose infectieuse.

L’analyse de l’expression des médiateurs impliqués dans la réponse antimicrobienne notamment hBD1, hBD2, hBD3, S100A7, S100A8 et S100A9 après stimulation des CEGHA par les souches B128 et B128ΔcagM ne montre aucune induction de l’expression des ARNm codant pour les membres de la famille S ni de hBD Données non présentées . Parmi les -défensines analysées, on observe une induction dose et cagM-dépendante de l’expression de l’ARNm codant pour hBD2 après stimulation des CEGHA par H. pylori Figure . La hBD n’est pas induite par H. pylori en phase précoce d’infection, et ce indépendamment de la souche (Figure 27).

Figure 27. Profil d’expression des gènes associés à la réponse

immunitaire par les CEGHA stimulés par H. pylori pendant 3h

Les CEGHA ont été stimulées pendant 3h avec les souches de H. pylori B128 et B128 ΔcagM aux doses infectieuses 10 et 100 bactéries/cellule. Les niveaux d’expression relative des ARNm ont été déterminés par RT-PCR quantitative. Les résultats obtenus ont été normalisés par rapport à deux gènes contrôles et exprimés en facteur de modulation par rapport aux cellules non stimulées (moyenne ± erreur standard) (n=3).

Induction tardive de l’expression de certains médiateurs

Le profil des gènes codant les médiateurs inflammatoires et peptides antimicrobiens cités- ci-dessus après 24h de stimulation des CEGHA avec H. pylori est plus hétérogène.

La stimulation des CEGHA avec la souche de H. pylori B128 induit de manière dose-dépendante l'expression relative des ARNm codant pour les médiateurs inflammatoires IL-8, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CCL20, TNF- et COX par rapport aux contrôles non stimulés Figure . Aucune expression de l’ARNm codant l’)L- ou l’)L- n’a été observée. L’expression des ARNm codant les cytokines et chimiokines pro-inflammatoires IL-8, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CCL20, TNF- et COX par les CEG(A stimulées avec la souche B ΔcagM est dose dépendante Figure .

L’induction de l’expression de ces médiateurs ne semble pas dépendre de cagM à l’exception de COX qui est beaucoup plus fortement induit par les CEGHA stimulées par la souche B128 à la dose infectieurse de 100 bactéries/cellules par rapport à la souche B ΔcagM à la même dose Figure . L’expression de ce médiateur quasiment non détecté à h par les CEG(A est plus tardive au cours de l’infection par H. pylori (Figure° . De plus, l’expression des ARNm codant CXCL et CXCL est augmentée à h par rapport à leur expression à 3h et ceci est observé avec les deux souches de H. pylori Figure . L’induction de ces médiateurs après h de stimulation des CEGHA est indépendante de cagM. L’expression de l’ARNm des autres médiateurs, notamment l’)L-8, le CXCL , le CXCL , le TNF , et le CCL , après h de stimulation avec H. pylori est légèrement modifiée par rapport au temps précoce de 3h (Figure 28).

L’analyse de l’expression de hBD , hBD2, hBD3, S100A7, S100A8 et S100A9 a été également réalisée à h d’infection et aucune induction des ARNm codant pour les membres de la famille des S ni de hBD n’a été mise en évidence données non présentées . L’expression de l’ARNm codant hBD et hBD3 par les CEGHA stimulées par H. pylori est fortement dose et cagM-dépendante Figure . L’expression de l’ARNm codant hBD2 est plus importante après 24h de stimulation. Ceci a été observé avec les 2 souches de H. pylori (Figure 28). La défensine hBD3 semble avoir une expression plus tardive lors de l’infection par H. pylori puisque son expression n’est quasiment pas détectée au temps précoce d’infection.

La comparaison de l’expression des médiateurs inflammatoires au cours du temps a permis de mettre en évidence l’induction plus tardive de certains gènes tels que COX ainsi que l’expression de certains médiateurs non détectés à h tels que hBD . En revanche, une grande variabilité (écartypes) dans les résultats est notée à 24h par rapport au temps plus précoce h . L’augmentation de l’effectif dans les prochaines expériences d’infection permettra une meilleure analyse de cette réponse.

Figure 28. Profil d’expression des gènes associés à la réponse

immunitaire par les CEGHA stimulés par H. pylori pendant 24h

Les CEGHA ont été stimulées pendant 24h avec les souches de H. pylori B128 et B128 ΔcagM aux doses infectieuses 10 et 100 bactéries/cellule. Les niveaux d’expression relative des ARNm ont été déterminés par RT-PCR quantitative. Les résultats obtenus ont été normalisés par rapport à deux gènes contrôles et exprimés en facteur de modulation par rapport aux cellules non stimulées (moyenne ± erreur standard) (n=3).

VI.5.d. Comparaison des profils protéiques des CEGHA après exposition à