Comparaison dynamique (dynamic time warping : DTW)

A metodologia aplicada para a preparação dos géis de acrilamida encontra-se descrita por Igrejas [89] e os reagentes indicados na Tabela 5 e 6.

Tabela 5 - Reagentes utilizados para a realização de um gel de separação de 16 x 18 cm (Quantidades referentes a 2 géis) para a 1-DE.

Reagentes T=12,52% C=0,97% Acrilamida 40% 15,31 mL Bisacrilamida (Bis) 2% 3 mL Água Bidestilada 10,5 mL Tampão Tris HCl pH 8,8 18,8 mL Desgaseificação SDS 10% 0,5 mL APS 1% 1,25 mL TEMED 25 µL

Para a correcta e precisa realização dos géis de poliacrilamida, foram seguidos os seguintes passos [89]:

1. Preparar as placas de electroforese SDS-PAGE, tal como descrito por Igrejas para electroforese monodimensional de géis 16 x 18 cm [89].

2. Executar a preparação do gel de separação de acordo com a Tabela 5. Após a mistura dos primeiros quatro reagentes, a solução é depositada num kitasato que deverá ser fechado com o auxílio de uma rolha, para que a desgaseificação (com o auxílio duma bomba de vácuo) ocorra sem problemas.

3. Adicionar os restantes reagentes pela ordem em que se encontram apresentados na tabela (com cuidado especial para que não ocorra a formação de bolhas) após o término do processo de desgaseificação (o qual dura aproximadamente trinta minutos). O TEMED deve ser adicionado à solução com a ponta da micropipeta inserida na mesma e ressuspendido, para uma melhor polimerização.

4. Transferir a solução para um goblé com o auxílio de uma seringa, depositando a mesma nas placas de electroforese, com o cuidado de deixar uma margem de 3 cm até ao topo, para que posteriormente seja também depositado o gel de concentração. Após a deposição da mesma, são adicionados 160 µL de butanol ao longo da sua superfície, de modo a prevenir a formação novas bolhas de ar.

5. Proceder ao processamento do gel de concentração (Tabela 6) quando o gel de separação se encontrar polimerizado. Os passos necessários para a realização deste gel são idênticos ao do gel de separação. Este é colocado acima do gel de separação (após ser removido o butanol, com 3 lavagens), introduzindo um pente de 15 poços antes que ocorra a polimerização do mesmo.

Tabela 6 - Reagentes utilizados para a realização de um gel de concentração de 16 x 18 cm (Quantidades referentes a 2 géis) para a 1-DE.

Reagentes T=2,88% C=1,42% Acrilamida 40% 1,68 mL Bisacrilamida (Bis) 2% 0,49 mL Água Bidestilada 17,34 mL Tampão Tris HCl pH 8,8 2,81 mL Desgaseificação SDS 10% 0,5 mL APS 1% 1,25 mL

TEMED 25 µL

6. Retirar com especial cuidado o pente após o gel de concentração polimerizar (de modo a não danificar os poços), lavando os poços 3 vezes.

3.2.1.1.1. Preparação das amostras para a electroforese monodimensional

De modo a que a identificação das proteínas fosse efectuada com a maior precisão possível, foi necessário obter o maior número e ter a maior qualidade possível na extracção das mesmas. Como referido, foi necessário optimizar o protocolo de extracção das proteínas provenientes dos produtos de abortamento, aliado à técnica de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

O protocolo nº1 serve de base para a optimização da extracção das proteínas provenientes de produtos de abortamento. Nos protocolos seguintes, apenas serão referidas as modificações efectuadas relativamente ao protocolo nº1.

3.2.1.1.1.1. Protocolo nº1

1. Descongelar os falcons à temperatura ambiente e posteriormente submetidos a uma centrifugação a 5.000 rpm, a 4ºC durante 15 minutos.

2. Remover e descartar o sobrenadante após a verificação da formação de pellet. O pellet é transferido para um eppendorf e adiciona-se 200 µL de solução tampão de lise (Anexo 2), procedendo à fragmentação das células por acção mecânica através de 3 períodos de sonicação durante 10 segundos, com intervalo de 20 segundos, a 60% (do total de frequência da máquina Vibra Cell 75186 – VCX130), no gelo.

3. Centrifugar os eppendorfs a 13.000 g, a 4ºC, durante 30 minutos.

4. Se ainda se verificar a existência de pellet, repetir os passos 2 e 3 até que o mesmo se encontre dissolvido na solução de tampão.

5. Armazenar a -20ºC para posterior utilização.

6. Adicionar 0,5 mL de solução C (Anexo 2) antes de aplicar as amostras no gel. 7. Preparar as amostras para a corrida no gel SDS-PAGE (T = 12,52% e C = 0,97%) de 16 x 18 cm, 1mm de espessura e 15 poços.

8. Ordenar as amostras por ordem de inserção e preparar um registo para as amostras de condições de migração.

9. Introduzir cerca de 25 µL em cada poço.

10. Colocar o conjunto da placa e recipiente superior na tina de electroforese. Cobrir a tina de electroforese e ligá-la a uma fonte de alimentação. As condições de migração são de 30 mA/gel a 14ºC.

11. Concluir a migração quando a frente de migração sair das placas.

3.2.1.1.1.2. Protocolo nº2

O protocolo nº2 difere do primeiro no que diz respeito à recolha do sobrenadante dos eppendorfs.

2. Após a verificação da formação de pellet, é transferido 15 µL de sobrenadante para dois eppendorfs numerados (1 e 2) e 20 µL para outros dois eppendorfs (3 e 4). O pellet é transferido para outro eppendorf, adicionando-se 200 µL de solução de tampão de lise a todos os eppendorfs.

3. Os eppendorfs 1 e 3 são, juntamente com o pellet, sujeitos à fragmentação de células por agitação mecânica através de 3 períodos de 10 segundos, intercalados com pausas de 20 segundos, a 60% (do total da frequência da máquina Vibra Cell 75186 – VCX130). No entanto, os eppendorfs 2 e 4 são sujeitos às mesmas condições excepto a sonicação que é efectuada a 70% (do total da frequência da máquina Vibra Cell 75186 – VCX130).

4. Centrifugar os eppendorfs a 13.000 g, a 4ºC, durante 30 minutos (…).

3.2.1.1.1.3. Protocolo nº3

NOTA: Antes de iniciar este protocolo, fazer uma solução de ácido tricloroacético (TCA) a 20% (w/v) em acetona. Para isso, é necessário adicionar 30,67 g de TCA a 250 mL de acetona, agitar com o auxílio de um magneto e deixar a -20ºC.

As modificações efectuadas neste protocolo são referentes à colheita do sobrenadante tanto do eppendorf como do falcon, assim como a introdução de um método de precipitação de proteínas por acção do ácido tricloroacético (TCA) e acetona.

2. Após a verificação da formação de pellet, todo o sobrenadante é transferido para um novo falcon. Ao pellet é adicionado solução de tampão de lise e por acção mecânica, as células são fragmentadas por 3 períodos de sonicação durante 10 segundos, intercalado com pausas de 20 segundos, a 60% (do total da frequência da máquina Vibra Cell 75186 – VCX130), no gelo.

3. Adicionar a ambos os falcons aproximadamente 10 mL de TCA a 20% em acetona, transferir ambos para um falcon de 25 mL (perfazendo com a solução previamente utilizada) e repousar a -20ºC durante, no mínimo, 1 hora.

4. Centrifugar o falcon a 13.000 g, a 4ºC durante 30 minutos.

5. Remover cuidadosamente o sobrenadante e adicionar acetona previamente arrefecida a -20ºC, centrifugando o falcon a 13.000 g, durante 20 minutos. Repetir este passo duas vezes.

6. Remover o máximo de acetona possível e deixar evaporar overnight.

7. Adicionar 0,5 mL solução C (para efectuar a electroforese do tipo SDS-PAGE) ou 200 µL tampão de lise (para efectuar electroforese bidimensional) (…).