Comparaison des empreintes globales fongiques

Pommes collectées en Novembre 2013

Figure 3.5. Profils DGGE des ADNr fongiques extraits à partir de pommes biologiques et conventionnelles échantillonnées en 2013 (A) avec les analyses ACP (B)

et de clustering (C) correspondantes.

0.257

0.715

A

B

_C

Pommes collectées en Novembre 2014

Figure 3.6. Profils DGGE des ADNr fongiques extraits à partir de pommes biologiques et conventionnelles échantillonnées en 2014 (A) avec les analyses ACP (B)

et de clustering (C) correspondantes.

L’observation des profils DGGE, qui correspondent à l’image de la flore fongique présente à la surface des pommes, montre peu de variations entre les profils d’un même type d’agriculture pour les deux années d’échantillonnage (Figures 3.5.A et 3.6.A). La variation inter-fruits est en effet très faible, avec une similarité allant de 65 à 90% entre des pommes issues d’un même mode de production (Figure 3.5.C et 3.6.C). Nous pouvons également constater que la flore fongique semble plus riche sur les fruits issus de l’AB comparé aux

Rf

0.235

fruits issus de l’agriculture conventionnelle. En effet, le nombre de bandes ADN (richesse fongique), et donc d’espèces fongiques, retrouvées sur les fruits est significativement plus important sur les fruits provenant de l’AB (Tableau-3.2.) : on détecte en moyenne 28 bandes dans les échantillons bio (2013, 2014 et à partir des pommes bio des deux parcelles étudiées) et 17 dans les échantillons conventionnels (2013, 2014 et à partir des pommes bio des deux parcelles étudiées). Cela pourrait s’expliquer par le fait que les traitements chimiques autorisés en agriculture conventionnelle, en particulier les fongicides, détruiraient une grande partie de la flore fongique présente sur l’aliment.

Tableau 3.2. Nombre de bandes/espèces fongiques retrouvées sur les pommes étudiées.

Agriculture Nombre

d'échantillons

Nombre de bandes

DGGE (moyenne) Test de Student

Biologique 65 28

P < 0,05

Conventionnelle 60 19

Les profils DGGE ont été comparés par analyses statistiques, de type ACP, qui nous ont permis d'obtenir une représentation graphique de l’ensemble de nos échantillons (Figures 3.5.B et 3.6.B), et donc, de pouvoir réaliser une étude exploratoire des données quantitatives (indices de Dice) obtenues à partir des matrices de similarité. Les graphiques permettent de constater que les fruits sont regroupés en fonction de leur mode de production. La somme des pourcentages des deux premières composantes informe que 70% de la variation dans l’échantillonnage est représentée. De plus, la première composante contribue à elle seule et majoritairement (Fact.1 = 50 à 60%) à la dissociation des deux groupes qui correspondent aux pommes bio et conventionnelles (Figures 3.5.B et 3.6.B). Ces résultats sont retrouvés sur les dendrogrammes (Figures 3.5.C et 3.6.C) qui illustrent bien les deux classes d'intérêt (conventionnelle et biologique) et complètent l’information apportée par l’ACP en chiffrant le degré de similarité : les individus (pommes) sont regroupés soit dans le cluster « Biologiques », soit dans le cluster « Conventionnelles » avec environ 70% de similarité entre les pommes d’un même groupe. Deux valeurs aberrantes ont été supprimées, elles correspondaient aux deux colonnes présentes aux extrémités des gels DGGE, où les bandes sont le plus souvent inclinées et donc non exploitables. Cela a été généralement le cas pour l’ensemble des gels DGGE de l’étude.

Ainsi, l’application de la PCR-DGGE nous a permis d’avoir une vision globale de la flore fongique présente à la surface des fruits, et de constater qu’elle était associée au mode de

production. Il serait donc possible d’utiliser cette flore fongique naturelle pour discriminer les fruits bio des conventionnels. Mais cet effet lié au type d’agriculture est-il dominant sur les autres paramètres qui influencent la flore microbienne des fruits ?

Vérification de la robustesse de l’approche

Après avoir étudié l’impact des pratiques agricoles sur la flore fongique des fruits, la PCR-DGGE a ensuite été appliquée afin d’estimer la variabilité qui pourrait être due à la position du fruit dans la parcelle (au centre ou au bord) ou à l’année d’échantillonnage (2013 vs 2014). Les analyses décrites plus haut avaient été réalisées indépendamment de la position des pommes dans la parcelle.

Le but était de vérifier si les variations dans la flore microbienne des fruits dues au type d’agriculture sont plus importantes que celles liées à l’année d’échantillonnage ou à la position du fruit dans la parcelle. Et donc de vérifier la robustesse des profils DGGE fongiques obtenus pour la discrimination des fruits bio des fruits conventionnels.

Étude de l’effet intra-parcellaire

Toutes les pommes récupérées au bord d’une parcelle donnée (bio ou conventionnelle) ont été comparées avec celles prélevées au centre de cette même parcelle par PCR-DGGE, les pommes échantillonnées en 2013 ayant été étudiées séparément des pommes échantillonnées en 2014. Cela nous a permis de mesurer l’effet « intra-parcellaire » indépendamment de l’effet « traitements » et de l’effet « temporel ». L’ensemble des résultats obtenus ne sera pas illustré ici mais les analyses ACP et de clustering ont montré que les individus (pommes) avaient tendance à se regrouper en fonction de leur localisation dans la parcelle (bord vs centre). En effet, la comparaison de la flore fongique de fruits (bio ou conventionnels) récoltés au centre d’une parcelle avec des fruits prélevés au bord de cette même parcelle a montré qu'il existait une variation intra-parcellaire. Bien que cette différence soit minime, elle doit être prise en compte pour l’interprétation et la compréhension des résultats. Les échantillons avaient en effet tendance à se regrouper en fonction de la localisation du fruit dans la parcelle mais les différences n'étaient pas statistiquement significatives : les dendrogrammes obtenus après l’analyse de regroupement ne permettaient pas de faire ressortir de clusters spécifiques et les analyses ACP ne permettent pas de différencier les échantillons (données non présentées). Les variations entrainées par l’effet intra-parcellaire sur l’écosystème microbien des pommes seraient donc négligeables. Des essais de PCR- DGGE ont ensuite été réalisés avec à la fois des échantillons prélevés à différents endroits

A

B

C

d’une même parcelle et issus des deux types d’agriculture (Figure 3.7.). Cela nous a permis de vérifier si les variations observées dans les communautés microbiennes liées au mode de production prédominent sur celles entraînées par la position du fruit dans la parcelle. La figure suivante illustre un exemple de gel DGGE réalisé pour répondre à cette hypothèse. Il s’agit des échantillons de pommes récoltés durant la deuxième année d’échantillonnage. Les résultats sont similaires avec ceux obtenus pour les pommes prélevées durant la première année d’échantillonnage.

Pommes collectées en Novembre 2014

Figure 3.7. Profils DGGE des ADNr fongiques extraits à partir de pommes biologiques et conventionnelles échantillonnées en 2014 (A) avec les analyses ACP (B)

et de clustering (C) correspondantes. Rf

0.235

L’analyse statistique de similarité (Figure 3.7.) conforte l’observation du gel DGGE puisque la flore fongique des pommes issues de l’AB se différencie de celle issue de l’agriculture conventionnelle avec 60% de similarité entre bio et conventionnel (Figure 3.7.C). Et ce, indépendamment de la localisation du fruit dans la parcelle. L’ACP est en accord avec les résultats de l’analyse de similarité. En effet, l’axe 1 permet de dissocier les échantillons par rapport à leur mode de production tandis que l’axe 2 les dissocie en fonction de leur localisation dans la parcelle. L’axe 1 contribuant davantage à la discrimination globale des échantillons que l’axe 2 (Fact.1 = 56,36% et Fact.2 = 14,16%), l’effet lié au mode de production apparait donc plus important que celui lié à la position du fruit dans une parcelle.

La prochaine étape consistait à savoir si en incluant dans l’analyse des pommes bio issues d’une autre parcelle nous pourrions toujours différencier les deux types de fruits. Nous avons pour cela prélevé de façon aléatoire, durant la deuxième année d’échantillonnage, des pommes bio (n = 5) cultivées sur une autre parcelle de Invenio (parcelle de Ste Livrade certifiée bio depuis 2011).

A

B

C

Figure 3.8. Profils DGGE des ADNr fongiques extraits à partir de pommes biologiques et conventionnelles échantillonnées en 2014 (A) avec les analyses ACP (B)

et de clustering (C) correspondantes.

« Parcelle 2» = pommes biologiques d’une autre parcelle.

0.180

0.668

Lorsque les données des pommes bio provenant d'une autre parcelle (Parcelle 2 sur la Figure 3.8.) sont ajoutées à celles que nous avions obtenues pour les autres échantillons de pommes, les interprétations statistiques nous permettent de constater que ces pommes sont regroupées dans le cluster bio avec près de 75% de similarité (Figure 3.8.B). De plus, l’ACP, représentée avec deux facteurs, explique jusqu’à 75% des variations (Figure 3.8.C). La première composante principale contribue de façon significative (Fact.1 = 61,90%) à la dissociation des pommes bio des pommes conventionnelles (Figure 3.8.B). La deuxième composante dissocie principalement les pommes bio selon si elles proviennent de la Parcelle 2 ou de l’autre parcelle. Le pourcentage de cette deuxième composante étant faible (Fact.2 = 15,23%), ce paramètre n’influence donc pas majoritairement la composition de la communauté bactérienne des pommes.

Ces résultats ont été obtenus pour les échantillons de 2014 mais aussi pour les échantillons de 2013 (données non représentées). Cela souligne bien le fait que le mode de production a une plus grande influence sur la flore fongique des pommes par rapport à leur position dans la parcelle.

Nous sommes ensuite passés à l’étude de l’effet « temporel » (année d’échantillonnage) sur les profils fongiques obtenus par PCR-DGGE. Cela nous a permis de vérifier si les variations observées dans les communautés microbiennes liées au mode de production prédominent sur celles entraînées par l’année de récolte (2013 vs 2014).

C

A

B

Étude de l’effet temporel

Figure 3.9. Profils DGGE des ADNr fongiques extraits à partir de pommes biologiques et conventionnelles échantillonnées en 2013 et en 2014 (A) avec les analyses ACP (B)

et de clustering (C) correspondantes.

0.235

0.700

Les profils DGGE obtenus (Figure 3.9.) permettent d’avoir un aperçu des communautés fongiques présentes à la surface de pommes bio et conventionnelles échantillonnées sur deux périodes de récoltes différentes (2013 vs 2014). L’ACP, réalisée à partir des données extraites des profils DGGE fongiques, explique jusqu’à 70% de la variance sur les deux premières composantes (Figure 3.9.B). La première composante (Fact.1 = 39,70%) permet de séparer les échantillons en deux groupes distincts, « Biologiques » et « Conventionnelles ». La deuxième dissocie également les échantillons en deux groupes (Fact.2 = 29,70%), « 2013 » et « 2014 » (Figures 3.9.B). Cependant, l’axe 1 étant plus important que l’axe 2 (Fact.1 = 39,70%), cela indique que le type d’agriculture influence de façon majoritaire la composition de la structure des communautés fongiques. Le dendrogramme de la Figure 3.9.C conforte les interprétations de l’ACP. Il démontre que la flore fongique des pommes issues de l’AB se différencie de celle présente à la surface des pommes conventionnelles, avec plus de 60% de similarité entre des pommes provenant d’un même mode de production (bio ou conventionnel). Et ce, indépendamment de l’année d’échantillonnage des fruits.

La même méthodologie a ensuite été appliquée, cette fois-ci pour la comparaison de l’empreinte génétique bactérienne afin de savoir si, tout comme la flore fongique, la flore bactérienne pouvait être utilisée pour la discrimination des pommes en fonction de leur mode de production.