Chromatographie en phase liquide

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est aussi une technique de séparation performante, qui permet également l’identification et la quantification des composés d’un mélange.

7.1.2.1. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse

La détection a beaucoup évolué dans le domaine de l’HPLC, particulièrement le couplage avec la spectrométrie de masse qui nécessite de contourner certains problèmes dus aux conditions opératoires des deux techniques telles que le vide poussé, la phase gazeuse et la haute température pour la spectrométrie de masse et la haute pression et la phase liquide en HPLC. Un tel problème est résolu par l’innovation des interfaces de couplage qui permet le transfert des ions de la source opérant à pression atmosphérique à l’analyseur opérant à des pressions de l’ordre de 10-5 Torrs, le but étant d’éliminer le maximum de molécules neutres avant d’arriver à l’analyseur. Ce filtrage est effectué soit par :

des interfaces à rideau de gaz : un rideau de gaz (N2) qui repousse les neutres non

chargés circule entre la source et la zone de vide primaire. Les ions soumis à une différence de potentiel sont accélérés dans l’analyseur;

des interfaces à système de filtrage chauffant : les ions en sortie de source

atmosphérique traversent une zone chauffée sous vide primaire qui élimine la grande partie des neutres.

En outre, il existe plusieurs combinaisons de couplages avec les différents types d’analyseur. Dans ce qui suit, on décrira succinctement le couplage avec les analyseurs quadripolaires et temps de vol (Qq-TOF). Le principe de fonctionnement d’analyseur quadripolaire a été décrit précédemment, alors que celui d’analyseur à temps de vol repose sur la mesure du temps nécessaire pour parcourir la distance L entre la zone d’accélération (potentiel Vs) et le détecteur

(Figure II. 13). Le phénomène physique de séparation obéit à certaines équations (Équation II. 1) qui décrivent l’action d’un champ électrique constant sur une particule chargée.

L'énergie cinétique Ec acquise en fin d'accélération pour un ion à la sortie de la source, est égale à qVs : Ec = ^૚ ૛

.

q : charge de l’ion

Vs : potentiel d’accélération

Figure II. 13 : Schéma de principe d’analyseur à temps de vol (TOF).

Le passage dans le tube de vol est accompagné par la séparation des ions selon leur vitesse v et selon leur masse (m) (Équation II. 2).

v2 = ^{2. z. e. Vs}

m Équation II. 2

Ainsi, le temps nécessaire pour parcourir la distance L est donné par l’Équation II. 3.

t = (2 xs + L)

ට

s Équation II. 3

Tous les ions, quelle que soit leur masse, possèdent la même énergie cinétique Ec à la sortie du champ d'accélération Vs. À ce niveau, les ions arrivent dans une région libre de champ où ils ne sont plus soumis à aucune force et sont animés d'un mouvement rectiligne uniforme. Ces ions possédant des masses différentes et une énergie cinétique identique ont donc des vitesses différentes. En conséquence, les ions les plus légers ont une vitesse plus grande que les ions plus lourds. En réalisant, non pas un faisceau ionique continu, mais un faisceau « pulsé », il sera possible de séparer les ions dans le temps, à condition qu'ils partent tous en même temps de la fente d'entrée du système dispersif. Cet analyseur est connu depuis longtemps pour sa sensibilité, sa haute résolution et son excellente stabilité permettant la mesure exacte des masses. Ainsi avec les hybrides (Qq-TOF), on accède à la mesure exacte en mode tandem (MS / MS) et à des informations structurales intéressantes.

7.1.2.2. Chromatographie d’extraction en phase solide (SPE)

La chromatographie SPE est analogue à celle de la chromatographie de partage mais aussi à la chromatographie préparative. Elle consiste à traiter une quantité importante de charge et à collecter les solutés séparés, dont la pureté est contrôlée par chromatographie analytique. Elle se compose généralement de quatre étapes : étapes de conditionnement, de chargement, de lavage et d’élution (Figure II. 14).

Figure II. 14 : Schéma du principe de la chromatographie SPE.

La première étape est le conditionnement de la phase stationnaire. Elle permet de la mouiller au moyen d’un solvant organique et d’activer les sites de rétention, siège des interactions moléculaires.

La seconde étape est le dépôt de l’échantillon. Le but est de provoquer une rétention quantitative des analytes sur la phase stationnaire qui peut être faite par percolation de l’échantillon sous pression. Pour un maximum d’efficacité, la vitesse d’écoulement de l’échantillon doit être modérée.

L’étape suivante est le lavage, elle n’est pas systématique, elle a pour but d’éliminer des interférents retenus. Il faut choisir des solvants de faible force éluante (exemple : mélange méthanol / eau) pour n’éluer que les interférents.

La dernière étape est celle de l’élution. Il est préférable d’utiliser le solvant de la plus faible force éluante possible capable d’entraîner la totalité des molécules évitant ainsi l’élution des interférents fortement retenus. Le choix du solvant est aussi guidé par sa facilité d’évaporation ou sa compatibilité avec la technique analytique suivante. La vitesse d’écoulement du solvant doit être lente pour favoriser l’élution.

7.1.2.3. Identification des constituants d’un mélange

L’identification se fait, tout d’abord, par superposition de deux chromatogrammes : le profil chromatographique et l’empreinte masse des standards et celui de l’échantillon à analyser, obtenus dans les mêmes conditions chromatographiques. Puis, il est indispensable de comparer les spectres UV-Visible et celui de spectrométrie de masse des composés dont deux pics chromatographiques ont un temps de rétention proches ou identiques.