Choix du solvant organique

II. Choix du solvant organique

Dans cette partie, le choix du solvant d’extraction est crucial. Celui-ci doit remplir plusieurs critères :

- le solvant organique doit être un excellent solvant pour les molécules phénoliques de faibles masses molaires de type vanilline, gaïacol, phénol etc. En effet, il est capital que ces espèces soient extraites du milieu le plus rapidement possible.

- il ne doit pas extraire la lignine, la laccase et le médiateur : ces trois molécules doivent rester en phase aqueuse pour que l’oxydation soit menée à bien. Dans cette optique, l’utilisation de l’ABTS en tant que médiateur est un choix judicieux. En effet, cette molécule est faiblement soluble dans les solvants organiques,

O

2

LMS

Phase aqueuse Phase organique

Figure 82 : Stratégie d'oxydation de la lignine par le LMS en milieu biphasique.

Sept solvants ont été testés au cours de cette étude (Figure 83). Ils ont été sélectionnés pour leur faible toxicité et leur disponibilité. Il s’agit principalement d’alcools, de cétones et d’esters faiblement miscibles avec l’eau.

II.1. Capacité d’extraction des solvants : calcul de coefficients de

partage.

L’aptitude des sept solvants organiques à extraire des monophénols dérivés de la lignine du mélange tampon acétate/dioxane a été évaluée en utilisant la vanilline comme molécule-cible. Pour cela, elle a été dissoute dans le tampon acétate contenant 25 % (v/v) de dioxane à une concentration de 0,5 mg/mL. Un volume équivalent de solvant organique est ajouté à la solution et l’ensemble est agité à 30°C pendant deux heures. La concentration en vanilline dans chacune des phases est alors évaluée par HPLC. Pour des concentrations faibles en soluté, on définit le coefficient de partage (K) comme le rapport des concentrations en vanilline entre les deux phases à l’équilibre :

K =^{Concentration en phase organique} Concentration en phase aqueuse

Ainsi, plus la valeur de K est élevée, plus la capacité d’extraction du solvant organique est importante. Les valeurs de K des solvants organiques testés sont regroupées dans le Tableau IX. Trois solvants possèdent des coefficients de partage élevés et pourraient ainsi être étudiés comme solvants d’extraction dans notre système biphasique. Il s’agit de l’acétate d’éthyle (AcOEt), de la méthylisobutyl cétone (MIBC), et de la 4-phényl-2-butanone. Ce dernier solvant possède une température d’ébullition élevée qui pourrait causer des difficultés pour l’isolation des molécules extraites. Son coefficient de partage n’étant pas meilleur que ceux de l’AcOEt et de la MIBC, il n’a pas été sélectionné pour la suite de cette étude. Ainsi, seuls l’AcOEt et la MIBC ont été utilisés.

Tableau IX : Coefficients de partage de divers solvants organiques. La phase aqueuse est constituée de 75 % (v/v) de tampon acétate et de 25 % (v/v) de dioxane.

Solvant _undécanol ^1- _octanol ^1- _octanol ^3- _benzylique ^Alcool

4-phényl-

2-butanone ^{MIBC AcOEt}

.

Figure 83 : Solvants organiques étudiés pour l'extraction de la vanilline dissoute en phase aqueuse.

II.2. Activité de la laccase en présence des solvants d’extraction

Bien que la réaction d’oxydation de la lignine par le LMS soit conduite dans un milieu biphasique, une partie du solvant d’extraction est toujours miscible au mélange tampon/dioxane. À titre d’exemple, la solubilité de l’AcOEt est de 8,7 g/100 mL dans l’eau à température ambiante ; celle de la MIBC est égale à 1,9 g/100 mL. La présence de ces solvants organiques en phase aqueuse peut altérer l’activité de la laccase. Ainsi, les travaux présentés dans ce paragraphe visent à évaluer l’impact de la présence de

1-undécanol 3-octanol 1-octanol Acétate d’éthyle (AcOEt) Méthylisobuthyl cétone (MIBC) 4-phényl-2-butanone Alcool benzylique

La présence de l’acétate d’éthyle dans le mélange tampon/dioxane entraine une baisse d’activité de la laccase de 30 % par rapport au mélange non saturé. Par ailleurs une conversion 20 % plus faible est atteinte en fin de réaction lorsque le milieu est saturé en AcOEt. Ce solvant organique a donc un impact significatif sur le fonctionnement de l’enzyme. L’activité de la laccase reste cependant suffisamment élevée pour procéder à l’oxydation de la lignine par le LMS.

Figure 84 : Suivi de l'oxydation de l'ABTS par la laccase dans plusieurs systèmes de solvants. L’influence du dioxane et de l’AcOEt sur l’activité enzymatique est évaluée.

Tableau X : Valeurs caractéristiques issues de l'oxydation de l'ABTS par la laccase dans plusieurs systèmes de solvants.

Activité (U) Conversion Temps au plateau

Tampon seul 0,105 94 % 60 s Tampon / dioxane 0,011 91 % 800 s Tampon / dioxane saturé AcOEt ^{0,008 70 % 800 s} 0,0E+00 5,0E-06 1,0E-05 1,5E-05 2,0E-05 2,5E-05 0 200 400 600 800 1000 1200 C on cen tration en m ol/ L Temps en s Tampon seul Tampon / dioxane Tampon / dioxane saturé AcOEt Cmax (théorique)

De façon inattendue, de meilleurs résultats sont obtenus dans le mélange tampon/dioxane saturé en MIBC que dans le même système non saturé (activité plus élevée et meilleure conversion). La MIBC semble ainsi être un solvant plus compatible avec la laccase que l’AcOEt. Les structures de ces deux solvants étant proches, il est peu probable que cette différence de comportement soit uniquement due aux interactions entre la laccase et le solvant organique. L’explication réside certainement dans leur différence de miscibilité dans la phase aqueuse : la MIBC étant moins soluble dans l’eau, elle est présente en concentration plus faible que l’AcOEt dans le système tampon/dioxane et altère ainsi moins le fonctionnement de l’enzyme. Par ailleurs, le dioxane possède une miscibilité élevé dans la MIBC. Ainsi, lors du processus de saturation du mélange tampon/dioxane, une partie du dioxane est extraite dans la MIBC et la concentration en dioxane diminue dans la phase aqueuse. Ceci explique les meilleurs résultats obtenus avec le solvant saturé en MIBC.

Figure 85 : Suivi de l'oxydation de l'ABTS par la laccase dans plusieurs systèmes de solvants. L’influence du dioxane et de la MIBC sur l’activité enzymatique est évaluée.

Tableau XI : Valeurs caractéristiques issues de l'oxydation de l'ABTS par la laccase dans plusieurs systèmes de solvants. 0,0E+00 5,0E-06 1,0E-05 1,5E-05 2,0E-05 2,5E-05 0 200 400 600 800 1000 C on cen tration en m ol/ L Temps en s Tampon seul Tampon / dioxane Tampon / dioxane saturé MIBC Cmax (théorique)

L’oxydation de la lignine par le LMS en milieu biphasique est un procédé complexe impliquant de nombreux paramètres. La mesure de l’activité de la laccase dans différents systèmes de solvants donne des informations préliminaires cruciales mais insuffisantes pour prédire le comportement de la laccase lors du procédé LMS complet. Ainsi, bien que la MIBC semble être le solvant d’extraction le plus compatible avec la laccase, l’AcOEt a également été utilisée pour l’oxydation de la lignine en système biphasique par le LMS.