Choix  de  l’approche  expérimentale

La première étape de notre travail consistait à purifier tous les complexes protéiques contenant DDX6 à partir de cellules humaines.

1.1. Choix de l’approche expérimentale

Principe du TAP-tag

La technique de TAP-tag (Tandem Affinity Purification) permet la purification rapide de complexes protéiques assemblés dans les cellules. Elle a été développée en 1999 chez la levure (Rigaut et al., 1999), puis s’est avérée efficace dans d’autres types cellulaires et organismes. Cette technique repose sur l’incorporation de plusieurs étiquettes à la protéine d’intérêt, et sur son expression dans la lignée cellulaire choisie. La protéine étiquetée formera in vivo des complexes avec ses partenaires protéiques. Ces complexes protéiques seront purifiés en utilisant successivement des résines ayant une affinité pour l’une et l’autre des étiquettes. Le TAP-tag initial a été réalisé en fusionnant la CBP (Calmoduline Binding

Protéine) et la protéine A, à la protéine d’intérêt. Un site de clivage a été inséré entre la CBP

et la protéine A, permettant la purification sur une résine sur laquelle est fixée la calmoduline d’une part, puis une résine sur laquelle sont fixés des IgG (Rigaut et al., 1999). Depuis, plusieurs techniques dérivant de cette technique initiale ont été mises en place.

Mise au point de la stratégie expérimentale

La protéine DDX6 a été fusionnée aux étiquettes FLAG (1KDa) et HA (1KDa) (Figure R1). En effet, la petite taille de ces étiquettes est un avantage puisque cela minimise le risque d’interférer dans l’assemblage des complexes que nous cherchons à purifier. Ces étiquettes permettent la purification des complexes en ajoutant à la résine les peptides FLAG et HA en excès. L’étiquette FLAG a été fusionnée en N-terminal et HA en C-terminal de la protéine DDX6, afin de ne purifier que les complexes contenant la protéine DDX6 entière.

Les complexes protéiques présents dans les cellules transfectées ont été purifiés en deux temps : sur une résine portant des anticorps dirigés contre une étiquette, puis sur une résine portant des anticorps dirigés contre la deuxième étiquette (Figure R2). Cette purification en deux étapes successives sur deux supports différents permet de réduire considérablement le bruit de fond.

Pour optimiser la double purification, l’efficacité des peptides FLAG et HA permettant l’élution des complexes adsorbés aux résines a été testée. Pour ce premier essai, nous avons utilisé des cellules HeLa transfectées avec le plasmide codant pour la protéine FLAG-RFP-DDX6-HA (l’étiquette RFP est de 27 KDa), de façon à séparer davantage les protéines DDX6 endogènes (54 KDa) et recombinantes (masse théorique 82 KDa) sur gel. La double purification des complexes a été réalisée comme indiqué figure R3A. A l’issue de cette purification, les résines anti-FLAG et anti-HA ont été incubées avec du tampon Laemmli afin de décrocher les complexes non élués (Figure R3A et B).

Figure R 1 : Schéma du plasmide codant pour la protéine FLAG-DDX6-HA!

Figure R 2 : Stratégie préliminaire de purification des complexes protéiques contenant DDX6 Des cellules sont transfectées avec une protéine DDX6 étiquetée en ses 2 extrémités. Les lysats cytoplasmiques sont incubés avec une résine portant des anticorps dirigés contre l’une des étiquettes et élués avec le peptide correspondant. Ces éluats sont ensuite incubés avec une résine portant des anticorps dirigés contre l’autre étiquette et élués avec le peptide correspondant à l’autre étiquette.

Le peptide HA semblant peu efficace pour l’élution des complexes adsorbés sur la résine anti-HA, l’ordre de fixation sur les résines a été inversé. De plus, au vu du bruit de fond observé sur ce gel (3 dernières pistes du gel, figure R3), une étape supplémentaire de purification a été ajoutée, en incubant dans un premier temps les lysats cytoplasmiques avec une résine d’agarose ne portant pas d’anticorps, permettant d’éliminer les protéines se fixant à la résine de façon non spécifique.

Des cellules HEK293 ont été transfectées avec le plasmide codant pour la protéine FLAG-DDX6-HA. C’est l’efficacité de transfection, supérieure à 80% lors des expériences préliminaires, qui a finalement orienté notre choix vers cette lignée cellulaire (Figure R4).

A B

Figure R 3 : Double purification des complexes protéiques contenant la protéine FLAG-RFP-DDX6-HA

(A) Stratégie expérimentale de purification des complexes contenant la protéine FLAG-RFP DDX6-HA. (B) Séparation des éluats sur gel SDS-PAGE coloré au nitrate d’argent. Un quart de l’échantillon 1 a été déposé dans les puits 1 et 2, et trois quarts de l’échantillon 1 dans les puits 3 et 4. La flèche indique la localisation de la protéine FLAG-RFP-DDX6-HA.

Les lysats cytoplasmiques de cellules HEK293 transfectées avec le plasmide codant pour la protéine FLAG-DDX6-HA ont été incubés avec la résine anti-FLAG, l’élution s’est faite avec le peptide FLAG, puis les éluats ont à nouveau été incubés avec la résine anti-HA, l’élution finale étant réalisée avec du tampon Laemmli (Figure R5).

Figure R5 : Purification des complexes protéiques contenant FLAG-DDX6-HA

(A) Stratégie expérimentale de purification des complexes contenant la protéine FLAG-DDX6-HA. (B) Visualisation des éluats sur gel SDS-PAGE coloré au nitrate d’argent. La flèche indique la protéine recombinante FLAG-DDX6-HA.

A B

A

Figure R 4 : Contrôle de l'efficacité de transfection de la protéine FLAG-DDX6-HA dans les cellules HEK293

 Cellules HEK293 transfectées avec le plasmide codant pour la protéine FLAG-DDX6-HA, marquées avec l’anticorps dirigé contre l’étiquette FLAG. (Echelle : 10 µm).

Etant donné la qualité de purification, cette stratégie semble optimale pour la purification des complexes protéiques contenant la protéine DDX6.