Chapitre 2 : Matériel et méthodes
2.2 Chirurgies et expériences animales
Les souris utilisées pour les expériences animales ont été des souris transgéniques K14-H2B-GFP. Celle-ci ont la particularité de posséder un épiderme fluorescent (Rendl, Polak et al. 2008), puisqu’elles expriment la protéine fluorescente verte (GFP pour Green Fluorescent Protein) conjuguée à l’histone 2B (H2B) sous le contrôle du promoteur de la kératine 14 (K14). Ainsi, toutes les cellules de leur organisme exprimant la K14, comme les kératinocytes, émettent une fluorescence verte lorsqu’éclairées par une lumière UV. Une colonie de ces souris transgéniques a été établie à l’animalerie du centre d’organogenèse expérimentale de l’Université Laval / LOEX. Les souris fondatrices de cette colonie ont été gracieusement données par le laboratoire de la Dre Elaine Fuchs (Rockfeller University, New York City, NY, USA). Toutes les procédures impliquant la création de la colonie, ainsi que les expérimentations animales subséquentes, ont été approuvées par les comités d’éthique animale du CHU de Québec et de l’Université Laval.
Afin de vérifier les impacts des deux types de pansements biologiques sur des plaies cutanées murines, trois groupes expérimentaux ont été étudiés. Le premier groupe, servant de contrôle négatif, ne reçut aucun pansement. Les deuxième et troisième groupes ont reçu respectivement des pansements adipeux et des pansements conjonctifs. Le modèle choisi afin d’effectuer les expériences de guérison cutanée a été le modèle publié par le Dr Galiano en 2004 (Galiano, Michaels et al. 2004). Des modifications importantes ont cependant été apportées à ce modèle afin de le rendre compatible avec un retrait fréquent des pansements. Les étapes nécessaires pour obtenir le modèle de plaies pleines épaisseurs avec extenseurs en silicone sont représentées à la figure 2.2 A, tandis que les modifications apportées à ce modèle sont représentées en B et en D.
Figure 2.2 Dépôts des pansements biologiques sur les plaies. A) Plaies dénudées avec extenseurs en silicone; B) Dépôt du pansement biologique dans le lit de la plaie, puis ajout du treillis siliconé atraumatique et de l’hydrogel salin isotonique; C) Ajout d’une pellicule transparente semi-occlusive; D) Ajout d’un bandage cohésif enrobant le montage sous-jacent afin de le sécuriser; E) représentation schématique pour les groupes ayant reçu des pansements; F) représentation schématique pour le groupe contrôle sans pansement
biologique. Note : Afin d’augmenter la clarté des schémas, le bandage cohésif a été omis en E) et en F). ©Pascal Morissette Martin
Les animaux ont été anesthésiés, rasés et dépilés un à deux jours avant la journée des chirurgies. À ce moment, deux plaies ont été réalisées de part et d’autre de la colonne vertébrale des souris. Ces plaies pleines épaisseurs se rendaient jusqu’au muscle et ont été effectuées à l’aide d’un échantillonneur cutané de 8 mm de diamètre. Le paniculus carnosus a également été retiré. Par la suite, des extenseurs en silicone ont été sécurisés sur le pourtour des plaies, et ce, à l’aide de colle chirurgicale (Dermabond advanced™, Ethicon, Johnson & Johnson Medical, Markham, ON, Canada) et de huit points de suture (fils de soie 6-0, Ethicon, Johnson & Johnson Medical). Ces extenseurs, d’un diamètre interne de 13 mm, avaient préalablement été découpés à partir de feuilles de silicone de grade médical d’une épaisseur de 0,5 mm (Grace Bio-Labs, Bend, OR, USA), puis avaient été stérilisés à l’autoclave.
À la figure 2.2 B à F, il est possible de voir les diverses étapes du montage qui permet de rendre le modèle compatible avec des changements fréquents des pansements. Pour ce faire, des éléments ont dû être ajoutés sur le dessus des pansements biologiques. Ceux-ci étaient eux-mêmes déposés dans le lit des plaies (Figure 2.2 E). Dans le groupe sans pansement, les éléments étaient ajoutés directement dans le lit des plaies (Figure 2.2 F). La première composante est un carré de 1 cm2 d’un treillis siliconé atraumatique pour les plaies
(Mepitel®, Mölnlycke Health Care, Oakville, ON, Canada) qui est ajouté sur le dessus des pansements biologiques. Ce treillis a la particularité de ne pas adhérer aux surfaces avec lesquelles il est en contact lorsque celles-ci sont humides. Ainsi, c’est ce treillis qui permet d’enlever les couches subjacentes sans arracher les pansements biologiques (qui doivent par la suite être enlevés très délicatement) et donc sans endommager les langues de migration lors du retrait de ces pansements. La seconde modification apportée au modèle présenté dans la littérature est l’ajout d’environ 0,1 mL d’un hydrogel salin isotonique sans composés actifs (Normlgel®, Mölnlycke Health Care). Celui-ci permet de conserver une certaine humidité au niveau des pansements et des plaies. Ensuite, un film transparent semi-occlusif (TegadermTM transparent film,
3M, London, ON, Canada), qui participe également à conserver le montage humide, est taillé et déposé sur le dessus de l’hydrogel. Pour éviter que les souris n’endommagent les films transparents semi-occlusifs et les montages sous-jacents lorsqu’elles sont retournées dans leur cage, une mince couche de bandage cohésif (AMD Ritmed, Lachine, QC, Canada) est enroulée autour de leur corps (Figure 2.2 D). Ces bandages cohésifs sont installés de façon à ce que les animaux puissent se mouvoir avec facilité dans leur cage.
Lors des expériences animales, les 21 souris utilisées K14-H2B-GFP étaient âgées de 18 semaines et elles ont été divisées en deux cohortes (11 souris femelles et 10 souris mâles). La figure 2.3 représente une ligne du temps des deux expériences animales réalisées.
Figure 2.3 Ligne du temps des expériences animales. Le jour 0 représente le jour de la chirurgie et le premier jour où les plaies ont reçu des pansements. Exp #1 : n = 6 (pansements adipeux), n = 2 à 6 en fonction des jours d’analyses (pansements conjonctifs), n = 8 (plaies sans pansements). Exp #2 : n = 6 (pansements adipeux), n = 6 (pansements conjonctifs), n = 8 ou 10 en fonction des jours d’analyses (plaies sans pansements). ©Pascal Morissette Martin
Dans les deux cohortes, et donc pour les 42 plaies, les cinétiques de guérison ont été étudiées jusqu’au jour du sacrifice des souris. Les méthodes utilisées pour ce suivi sont décrites dans la section 2.3. Vers la fin de la guérison (fermeture des plaies macroscopiques près de 90-95%), les tissus cicatriciels ont été prélevés et analysés. Dans la première expérience, soit celle comprenant les 10 souris mâles, les tissus cicatriciels ont été prélevés au 18ème jour et ont été analysés à l’aide de diverses méthodes histologiques, décrites dans la
section 2.4. Pour la seconde cohorte, soit celle utilisant les 11 souris femelles, les tissus ont été prélevés au 21ème jour. Ceux-ci ont été utilisés afin de réaliser des tests de résistance mécanique. Ces tests seront
détaillés dans la section 2.6. Pour les deux cohortes, le dernier jour où les plaies ont reçu un nouveau pansement a été le 15ème jour. Toutes les plaies des groupes traités ont donc reçu des pansements pour une
durée totale de 18 jours.