Foram utilizados seis mapas genéticos de trigo para a geração do mapa consenso base para este estudo. O mapa gerado, o qual composto por marcadores SSR, DArT, SNPs (de distintas plataformas) e alguns genes, apresentou 52.743 loci
0 50 100 150 200 250 I I e II II III IV
no total, com média de 2.512 marcadores e 204 centimorgans de comprimento por grupo de ligação (Tabela 2).
Este mapa pode ser utilizado como referência para diversos outros estudos em trigo, já que foi composto por grande parte dos marcadores moleculares mais utilizados para genotipagem e mapeamento de QTL nesta espécie, provenientes de mapas de alta qualidade (CAVANAGH et al., 2013; WANG, S. et al., 2014) e pelo procedimento mais otimizado até o momento disponível (ENDELMAN; PLOMION, 2014). A planilha eletrônica (formato .xls) está disponível no Apêndice D (formato digital).
4.3.3 Projeção e meta-análise de QTL
Dos 556 QTL coletados da literatura, 365 puderam ser projetados no mapa genético consenso (Figuras 2 a 8). Optou-se por não utilizar nesta análise QTL mapeados com o auxílio de marcadores AFLP (polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados, do inglês amplified fragment length polymorphism) e RFLP, os quais geralmente são provenientes de mapas menos densos, além de serem marcadores sobremaneira obsoletos. Os demais QTL que não puderam ser projetados o foram devido à ausência dos marcadores que mapeiam estes loci no mapa consenso. Isto se deu porque também procurou-se priorizar a qualidade do mapa genético consenso com a utilização de somente mapas de maior qualidade.
Foi possível realizar a meta-análise de QTL em 15 dos 21 grupos de ligação do trigo. De um total de 327 QTL, 72 meta-QTL foram detectados, dos quais 36 se localizaram no genoma A, 26 no genoma B e 10 no genoma D da espécie. Nos cromossomos 1D, 3D, 5D, 6D, 7B e 7D, o número de QTL projetados (menor que 10) foi insuficiente para a realização da meta-análise, uma limitação do método. Ainda assim, o cálculo do intervalo de confiança de cada QTL e a sua projeção em um mapa comum, servem como relevantes referências para futuros estudos que venham a identificar QTL ou genes em qualquer destas regiões como responsáveis pela resistência à giberela em trigo.
Tabela 2 - Mapa genético consenso de trigo, gerado a partir de mapas compostos por marcadores moleculares do tipo SSR, DArT, SNP e alguns genes
Grupo de ligação (cromossomo)
Mapa consenso
Comprimento (cM) Número de marcadores
1A 183,0 2.780 1B 174,1 4.186 1D 209,8 1.439 2A 233,6 2.735 2B 289,0 4.198 2D 156,7 2.042 3A 213,8 2.360 3B 204,3 3.632 3D 172,9 1.355 4A 211,1 2.566 4B 129,7 1.786 4D 170,4 515 5A 197,9 2.972 5B 280,1 3.680 5D 224,0 1.265 6A 183,4 2.878 6B 203,0 3.263 6D 220,3 880 7A 226,3 3.349 7B 235,5 3.102 7D 241,3 1.760 Média 204,0 2.512 Total 4.080,1 52.743
Adicionalmente à forma gráfica, os meta-QTL gerados através deste estudo são apresentados no Apêndice E, com a sua posição no mapa consenso e intervalo de confiança, cujas informações e a posse do mapa genético consenso, permitem que se selecionem os marcadores mais proximamente ligados a cada loci, e ao mesmo tempo de maior conveniência ou disponibilidade do pesquisador, para a condução de
novas pesquisas utilizando estas regiões, especialmente em programas de melhoramento.
No cromossomo 1A, 19 QTL foram projetados os quais geraram 6 meta-QTL, já no cromossomo 1B, também 19 QTL foram projetados, entretanto foram gerados somente 3 meta-QTL. Apesar de não ter sido possível realizar a meta-análise para os QTL do cromossomo 1D, é possível se observar pelo menos uma região onde 4 dos 8 QTL se co-localizaram (Figura 2).
Figura 2 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 1A, 1B e 1D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTL entre si (dentro dos grupos de ligação) e demonstrar a contribuição dos QTL ou parte destes na formação de cada meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
O grupo homeólogo 2 (2A, 2B e 2D) foi o que apresentou o maior número de meta-QTL, sendo que no cromossomo 2A foram verificados, a partir de 22 QTL, 8 meta-QTL. Já nos cromossomos 2B e 2D foram encontrados 3 e 7 meta-QTL a partir de 12 e 29 QTL projetados, respectivamente (Figura 3).
10 cM:
183 cM 174,1 cM
10 cM:
209,8 cM
Figura 3 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 2A, 2B e 2D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTL ou parte destes na formação de cada meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
233,6 cM 10 cM: 289 cM 10 cM: 156,7 cM 10 cM:
O maior número de meta-QTL detectados em um cromossomo representa maior riqueza em loci para uma característica do que o número total de QTL mapeados, os quais muitas vezes são redundantes, representando uma mesma região cromossomal. No entanto, sem a projeção e análise conjunta destes QTL, esta constatação não é possível de ser feita com segurança, daí a importância deste tipo de análise aqui descrito.
A exemplo do que ocorreu em outros grupos de ligação, alguns meta-QTL corresponderam a um único QTL projetado (um exemplo em 2A, um em 2B e dois em 2D). Nestes casos, não é possível se afirmar se existe variabilidade genética para estes loci no pool gênico do trigo, até que em novas populações se encontrem outros QTL nestas regiões. Ainda, a escassez de QTL projetados não permite um refinamento da região do cromossomo (hotspot) onde os genes responsáveis pela resistência à giberela estariam localizados.
No cromossomo 3A, 3 meta-QTL foram detectados (a partir de 10 QTL) e no 3D somente 6 QTL puderam ser projetados (Figura 4). O cromossomo 3B foi aquele onde mais loci foram projetados neste estudo, sendo um total de 62, que formaram 6 Meta-QTL. Este cromossomo é de fato aquele onde a literatura reporta o maior número de QTL mapeados em trigo para a resistência a giberela até o presente momento, em um total de 81 coletados neste estudo, como já citado anteriormente. Dois destes meta-QTL, precisamente posicionados (dado pelo curto segmento que representam) localizados no braço curto deste cromossomo, foram gerados com a sobreposição de 38 QTL. Sem a meta-análise, haveria a tendência de se afirmar que todos estes QTL correspondem à mesma região cromossômica, o que a análise contrariou.
O mais importante gene de resistência à giberela até hoje descoberto e elucidado, nomeado Fhb1, está localizado no braço curto do cromossomo 3B (BERNARDO et al., 2012; CUTHBERT et al., 2006; GUNNAIAH et al., 2012; RAWAT et al., 2016). Neste estudo, a posição deste gene coincide com a região que corresponde ao primeiro meta-QTL deste cromossomo (partindo-se da extremidade superior). O segundo meta-QTL, no entanto, bastante próximo a este e originário da projeção do mesmo grupo de QTL, não foi ainda reportado na literatura como uma
região contendo genes de resistência à esta moléstia, tratando-se, portanto, de uma promissora região para estudos aprofundados.
Figura 4 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 3A, 3B e 3D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTL ou parte destes na formação de cada meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
213,8 cM 10 cM: 172,9 cM 10 cM: 204,3 cM 10 cM:
A exemplo do grupo homeólogo 2, foi possível se realizar a meta-análise de QTL nos três cromossomos do grupo 4, sendo que 5, 4 e 3 meta-QTL foram gerados respectivamente em 4A, 4B e 4D (Figura 5).
Na coleta de dados realizada para este trabalho, foram reunidas informações sobre QTL de cinco tipos de resistência à giberela, os quais, tipo I: à infecção inicial; tipo II: ao alastramento; tipo III: ao acúmulo de micotoxinas; tipo IV: à infecção no grão; e a tipo I e II avaliadas de forma conjunta (BUERSTMAYR; LEMMENS, 2015; MESTERHAZY, 1995; MESTERHAZY et al., 1999; MILLER; ARNISON, 1986; SCHROEDER; CHRISTENSEN, 1963; WANG; MILLER, 1988). Todos estes QTL, os quais representam caraterísticas distintas, foram projetados em um mapa consenso e para a meta-análise considerou-se todos de forma conjunta, como responsáveis pela “meta-característica” resistência à giberela. Pode-se observar que a grande maioria dos meta-QTL gerados neste estudo foram compostos pela projeção de QTL relacionados a distintos tipos de resistência à esta moléstia, e muitas vezes a todos os possíveis, como ocorreu com o primeiro (superior) meta-QTL de 4B.
Ainda que exista esta classificação, a qual amplamente aceita, de tipos de resistência a giberela, é aceitável que tanto mecanismos similares atuem em cada tipo de resistência, ou que dentro destes QTL mapeados existam genes para vários atributos distintos. De fato, o mais importante loci para resistência à giberela já estudado, Fhb1, foi confirmado como conferindo resistência ao alastramento da moléstia (tipo II) e ao acúmulo com micotoxinas (tipo III) (LEMMENS et al., 2005).
Figura 5 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 4A, 4B e 4D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTLs ou parte destes na formação do meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
170,4 cM 10 cM: 211,1 cM 10 cM: 129,7 cM 10 cM:
Depois do cromossomo 3B, o 5A foi o segundo cromossomo onde o maior número de QTL são reportados na literatura e onde maior número destes foi projetado neste estudo (Figura 6). Outro aspecto comum entre 3B e 5A é que vários QTL (neste caso 42), foram projetados em uma região próxima e muitos destes sobrepostos, mas deram origem a dois meta-QTL distintos e de tamanho reduzido, os quais promissores para a mineração de genes (SWAMY et al., 2011).
No cromossomo 5B, 6 meta-QTL puderam ser obtidos, porém no 5D somente foi possível projetar 4 QTL. A quantidade insuficiente de QTL projetados para a realização da meta-análise ocorreu em 6 grupos de ligação neste estudo, entretanto, estes números devem ser incrementados em poucos anos. Mesmo após quase duas décadas de pesquisa na busca de QTL relacionados à resistência à giberela em trigo, os trabalhos continuam em uma taxa elevada (STEINER et al., 2017). Com o avanço nas tecnologias de genotipagem e nos métodos estatísticos e experimentais, vêm ganhando espaço os estudos de GWA (associação genômica ampla, do inglês
Genome Wide Association), onde inúmeros distintos genótipos são avaliados a cada
estudo, ao invés de somente pares de genótipos contrastantes em populações fruto do cruzamento entre estes (HUANG; HAN, 2014).
Em um estudo de GWA, 372 genótipos de trigo foram avaliados para a resistência à giberela e genotipados com 732 marcadores SSR, em que somente para a resistência tipo I, 861 associações marcador-fenótipo foram observadas, exemplificando a riqueza de informações obtida (KOLLERS et al., 2013). Em outro trabalho ainda mais recente, 272 genótipos foram fenotipados frente a moléstia e genotipados com quase 20 mil marcadores SNP do tipo GBS (genotipagem por sequenciamento, do inglês Genotyping By Sequencing) em que 10 altamente acuradas associações entre marcadores e a resistência a giberela foram observadas (ARRUDA et al., 2016). Este tipo de estudo deve alavancar a geração de dados acerca de loci e fontes de resistência a esta importante moléstia para triticultura.
Figura 6 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 5A, 5B e 5D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTLs ou parte destes na formação do meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
Dois casos de baixa precisão do posicionamento de meta-QTL foram verificados nos grupos de ligação 6A e 6B, onde ocorre a sobreposição de dois meta-
280,1 cM 10 cM: 197,9 cM 10 cM: 224 cM 10 cM:
QTL em cada (Figura 7). A meta-análise tem a finalidade de justamente separar os grupos de QTL e de restringir a região responsável por dada característica à menor porção possível (ou real). No caso destes meta-QTL sobrepostos, um maior número de QTL precisa ser projetado e incluído na meta-análise para que o agrupamento venha a separar estas regiões.
O segundo gene mais importante de resistência à giberela, conhecido e amplamente estudado é o Fhb2 (CUTHBERT; SOMERS; BRULÉ-BABEL, 2007; DHOKANE et al., 2016), o qual está situado na região que compreende o terceiro meta-QTL gerado de 6B (em amarelo). Este gene, confere a chamada “resistência de campo”, por apresentar a resistência combinada dos tipos I e II (CUTHBERT; SOMERS; BRULÉ-BABEL, 2007).
Figura 7 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 6A, 6B e 6D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTLs ou parte destes na formação do meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
O grupo homeólogo 7 foi o que apresentou o menor número de QTL projetados e também de meta-QTL (Figura 8). Somente no cromossomo 7A foi possível se realizar a meta-análise, onde foram verificados 5 meta-QTL. A projeção de um QTL
183,4 cM 10 cM: 203 cM 10 cM: 220,3 cM 10 cM:
com intervalo de confiança pouco preciso, levou a formação de um meta-QTL ainda maior que o QTL original (em roxo). Neste caso, esta é uma região de baixa confiabilidade para ser transferida por meio de seleção assistida por marcadores para o desenvolvimento de cultivares superiores de trigo.
Figura 8 - Projeção e, com bordas em verde, meta-análise de QTL de resistência à giberela em trigo para os cromossomos 7A, 7B e 7D. Na projeção, QTL em preto representam a resistência tipo I; em vermelho a tipo II; em azul a tipo I e II; em verde claro a tipo III e em laranja a tipo IV. Na meta análise as cores servem somente para diferenciar meta-QTLs entre si e demonstrar a contribuição dos QTLs ou parte destes na formação do meta-QTL. Os marcadores moleculares e suas posições em centimorgans são omitidos dos grupos de ligação para melhor visualização. Traço no centro de cada QTL representa o LOD score deste no trabalho original.
Este estudo trata-se da maior coleta e análise de dados de QTL de resistência à giberela até então realizada, e um dos maiores estudos deste tipo em trigo que se tem conhecimento. A totalidade de QTL aqui descritos pode receber o termo, recentemente proposto, de “QTLoma” (MARTINEZ et al., 2016; SALVI; TUBEROSA, 2015) da resistência à giberela em trigo, pois reúne em uma análise global a maioria e os mais importantes loci até hoje verificados para esta característica. A meta-análise aqui realizada compreendeu uma base de dados expressivamente maior e resultou em meta-QTL mais definidos (menores) que os estudos realizados por Liu et al. (2009), Löffler, Schön e Miedaner (2009) e Mao et al. (2010).
A redução da redundância se deu tanto em número de loci como no tamanho destes, assim, a seleção assistida para estes QTL por meio de marcadores
226,3 cM 10 cM: 235,5 cM 10 cM: 241,3 cM 10 cM:
moleculares deve ser facilitada, com a disponibilização de marcadores mais proximamente ligados a cada região. O QTLoma analisado servirá como um mapa de referência também para novos estudos de mapeamento de QTL para esta característica, determinando se novos loci são de fato originais ou correspondem a regiões já conhecidas.
Os meta-QTL possivelmente sejam regiões altamente ricas em genes. Para milho isto foi profundamente elucidado, em que o QTLoma da produtividade de grãos apresentou alta correlação com a densidade de genes no genoma desta espécie (MARTINEZ et al., 2016). Em arroz, dentro de meta-QTL relacionados à tolerância à seca, foram selecionados genes candidatos através de métodos de genômica comparativa, sendo grande parte destes genes previamente relacionados ao estresse em questão (SWAMY et al., 2011). Assim, a sequência deste estudo compreenderá a verificação in silico de genes e então genes diferencialmente expressos sob estresse da ocorrência de giberela dentro de cada meta-QTL gerado.
Ainda que a primeira versão da sequência do genoma de referência do trigo tenha sido publicada em 2014 (INTERNATIONAL WHEAT GENOME SEQUENCING CONSORTIUM, 2014), somente recentemente, durante o período de análises finais e redação deste trabalho, é que a primeira versão da anotação do genoma desta espécie foi disponibilizada no repositório do Consórcio Internacional do
Sequenciamento do Genoma do Trigo (https://www.wheatgenome.org/) (versão prévia
a própria publicação do artigo correspondente), o que impossibilitou que esta análise de busca de genes candidatos dentro dos meta-QTL fosse concluída até o momento. É importante salientar que após a identificação in silico de genes, a confirmação do envolvimento destes na resistência à giberela só pode ser realizada por métodos como clonagem, silenciamento ou outros ainda mais elaborados, como os metabolo- transcriptômicos e / ou proteômicos, como já realizado para os loci Fhb1 e Fhb2 (DHOKANE et al., 2016; GUNNAIAH et al., 2012; RAWAT et al., 2016). A informação então gerada pode inclusive ser aplicada em técnicas como a edição de genomas (BORTESI; FISCHER, 2015), o que enfatiza o longo percurso que a pesquisa tem a percorrer na busca de incrementar a resistência do trigo à giberela, assim como outras moléstias.
4.4 Considerações finais
Este estudo descreveu a análise do QTLoma da resistência à giberela em trigo e gerou um importante mapa de referência para a pesquisa com esta moléstia.
A redução da redundância e o refinamento das regiões mais provavelmente relacionadas à característica permitirão que o melhoramento genético possa otimizar a piramidação de loci, com marcadores proximamente ligados à estes.
A mineração de genes dentro dos meta-QTL gerados tornou-se facilitada, pelo encurtamento dos loci dentro do mapa genético, o que deve permitir o avanço da pesquisa na busca da compreensão dos mecanismos responsáveis pela resistência do trigo à giberela e mesmo outras moléstias.
5 Considerações finais gerais
O melhoramento genético e o trigo têm papel crucial no compromisso da agricultura de atender a demanda da humanidade por alimentos, hoje e no futuro. Para isto, o melhoramento precisa constantemente aprimorar novas estratégias.
Uma revisão bibliográfica foi realizada, visando contextualizar os avanços obtidos pelo melhoramento genético no cereal e as perspectivas para um futuro próximo, a qual compõem a parte inicial desta Tese. As prioridades do melhoramento, tendo sido aumentar o potencial produtivo a principal, assim continuarão a ser pelas próximas décadas, porém novos objetivos vêm surgindo, como a biofortificação. Antigas abordagens, como os híbridos, voltam a ganhar importância, graças ao avanço em diversas tecnologias, e novos métodos, como a edição de genomas, surgem com grande potencial.
O trigo possui uma naturalmente restrita variabilidade genética, o que vem sendo agravado pelo melhoramento e vem causando a estagnação dos ganhos de seleção deste e vulnerabilidade genética. Uma alternativa a isto é a utilização de espécies do pool gênico secundário em programas de introgressão, tendo Aegilops
speltoides já demonstrado grande potencial para melhorar o trigo. No Capítulo I, 236
segmentos cromossômicos desta espécie foram introgredidos, na forma de distintas linhagens, no background de trigo brasileiro e foi gerada uma série de informações que devem auxiliar na utilização desta variabilidade genética em programas de melhoramento.
A giberela é uma das principais moléstias da triticultura. A resistência genética é a principal forma de controle desta e inúmeros QTL têm sido mapeados no cereal,
no entanto, esta informação necessita ser globalmente analisada para ser melhor aproveitada em programas de melhoramento. No Capítulo II, foi realizada uma meta-