Chez les algues brunes : Les phlorotannins

Contrairement aux polyphénols des plantes terrestres, les enzymes de la voie de biosynthèse des phlorotannins ne sont pas connues à ce jour (Amsler and Fairhead 2006).

Les seules données disponibles au début de cette étude suggéraient que les phlorotannins pouvaient être formés par biosynthèse via la voie acétate-malonate aussi connue sous le nom de la voie des polycétides, par un processus qui pouvait impliquer une enzyme de type polyketide synthase de type III (Arnold and Targett 2002). L’annotation du premier génome d’une algue brune (Cock et al. 2010) a permis notamment d’identifier, par homologie de séquence avec les plantes terrestres, des gènes pouvant être impliqués dans le métabolisme des phlorotannins chez Ectocarpus. La voie du shikimate est aussi conservée chez Ectocarpus mais les enzymes clés telle que la PAL initiatrice de la voie des phénylpropanoïdes est absente. Comme vu précédemment, ceci souligne l’émergence du métabolisme des phénylpropanoïdes conduisant à la synthèse des flavonoïdes à partir de la colonisation terrestre par les végétaux de la lignée verte. D’autres enzymes clés pourraient cependant intervenir dans le métabolisme des phlorotannins notamment :

 3 gènes homologues de polyketides synthases de type III (PKSIII)  2 gènes homologues de chalcones isomérases-like (CHIL)

 4 gènes homologues d’aryl sulfotransférases (AST).

 1 gène homologue d’une vanadium bromoperoxidase (v-BPO) pouvant intervenir dans la bromination et la complexation des phlorotannins avec les alginates de la paroi

 1 gène homologue d’une UDP-glycosyltransférases (UGT) de la famille I qui regroupe toutes les UGTs qui modifient des composés phénoliques de plantes vasculaires.

Introduction générale

IV. Contexte et objectifs du projet de thèse

Cette thèse s’inscrit dans la continuité du projet Phlorotan-ING de l’Axe 1 Génomique et chimie bleue 2009-2012 du GIS Europôle Mer. Financée par la Région Bretagne, cette thèse a été réalisée au sein de la Station Biologique de Roscoff en collaboration avec le laboratoire du LEMAR (UBO) à Brest. Deux collaborations internationales ont également été réalisées, la première avec le laboratoire Géomar à Kiel en Allemagne et la deuxième avec le département des Sciences Environnementales de la Faculté Agricole, de l’Université de Dalhousie à Truro au Canada.

Ce projet de thèse s’est articulé autour de deux principaux objectifs : Le premier consistait à poursuivre l’étude de la voie de biosynthèse des phlorotannins par la caractérisation biochimique d’enzymes recombinantes de l’algue brune modèle Ectocarpus. Le deuxième objectif était d’utiliser ces connaissances dans le but d’obtenir des outils biomoléculaires afin d’étudier l’implication des phlorotannins dans les mécanismes de défense chez les algues brunes.

Ce manuscript est présenté en deux parties, la première partie est divisée en trois chapitres présentant les travaux réalisés ou initiés sur l’étude et la caractérisation biochimique de six enzymes cibles, la polyketide synthase de type III (Chapitre 1), les deux chalcones isomérase-like (Chapitre 2) et les trois aryl-sulfotransférases (Chapitre 3). La deuxième partie est également présentée en trois chapitres, elle porte sur les études écophysiologiques réalisées sur le modèle

Fucus vesiculosus. L’effet des rayonnements UV-B sera présenté dans le Chapitre 4, il sera suivi

de l’étude portant sur l’effet du broutage par Littorina littorea (Chapitre 5), puis de la présentation d’un essai biologique permettant de tester des molécules d’intérêt sur l’attachement des littorines au substrat (Chapitre 6).

Partie 1 : Voie de biosynthèse des phlorotannins

Chapitre 1: Caractérisation de la Polyketide Synthase de type III d’Ectocarpus. ... 29 Chapitre 2: Caractérisation biochimique et fonctionnelle de Chalcone Isomérases–like

d’Ectocarpus. ... 46 Chapitre 3: Etude préliminaire des aryl-sulfotransférases d’Ectocarpus: Surexpression des enzymes recombinantes. ... 73 Synthèse de la Partie 1 ... 84

Partie 1 : Voie de biosynthèse des phlorotannins

Présentation de l’article :

Ce chapitre présente les résultats obtenus à l’issue du projet Phlorotan-ING sous forme d’un article publié dans Plant Cell en 2013. Ce projet finalisé au début de cette thèse a permis la caractérisation fonctionnelle d’une Polyketide synthase de type III d’Ectocarpus. La caractérisation biochimique et structurale de cette enzyme a permis de révéler son implication dans la première étape de la voie de biosynthèse des phlorotannins ie. : la synthèse du phloroglucinol. La validation de la fonction biologique in vivo a également pu montrer une corrélation entre l’expression du gène codant la PKS III et la synthèse du phloroglucinol lors de l’acclimatation d’une souche d’eau douce d’Ectocarpus à l’eau de mer.

Ma contribution à cet article m’a permis d’acquérir les connaissances techniques pour la surexpression et la purification d’enzymes recombinantes ainsi que pour l’extraction et la caractérisation par GC-MS des ligands associés aux protéines. Ces compétences ont ainsi pu être exploitées lors des deux études suivantes sur les chalcones isomérases-like et les aryl sulfotransférases d’Ectocarpus.

Partie 1 : Voie de biosynthèse des phlorotannins

Présentation de l’article :

Ce chapitre présente l’étude menée sur les deux Chalcones isomérases-like d’Ectocarpus. La caractérisation biochimique des protéines recombinantes a été couplée à la caractérisation fonctionnelle sur le modèle plante Arabidopsis. Suite aux découvertes récentes sur cette classe de protéines ayant montré l’implication des CHI de type III dans le métabolisme des acides gras plutôt que dans le métabolisme des composés phénoliques chez les plantes, nous avons réorienté notre stratégie de caractérisation fonctionnelle par la collaboration avec l’équipe du Dr. Balakrishnan Prithiviraj du Département des Sciences Environnementales, à Truro au Canada. Cette étude est la première à présenter la complémentation d’Arabidopsis avec des gènes d’algues, apportant ainsi de nouvelles opportunités notamment pour la caractérisation des enzymes clés du métabolisme des phlorotannins chez les algues brunes.

Partie 1 : Voie de biosynthèse des phlorotannins

Article en préparation

Chalcone isomerase-like proteins from the brown alga Ectocarpus are fatty-acid

Dans le document Etude de la voie de biosynthèse des phlorotannins chez les algues brunes, de la caractérisation biochimique d'enzymes recombinantes à l'étude des réponses écophysiologiques (Page 41-66)