Os fingerprints vêm sendo utilizados como uma ferramenta bastante eficaz na identificação e controle de qualidade de espécies vegetais. Isso ocorre devido ao perfil de substâncias que o fingerprint oferece, pois normalmente as atividades de uma espécie vegetal de uso medicinal estão relacionadas com a atuação da matriz complexa, contendo diversas substâncias que atuam sinergicamente em um ou diversos receptores ao mesmo tempo. Nesse contexto, o perfil químico típico oferece uma imagem completa das substâncias que compõem a matriz, evidenciando as substâncias que possuem atividade farmacológica (LIANG et al., 2004; ZHANG et al., 2004; RODRIGUEZ et al., 2012).
Neste sentido, foram realizados ensaios comparativos em diferentes amostras de extratos brutos das folhas de pitanga com o objetivo de realizar o controle da qualidade das amostras atestando sua identidade através de fingerprints cromatográficos por CCD-
AE e CLAE-DAD. A amostra tomada como referência foi coletada em Porto de Galinhas (PE) identificada no Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) e utilizada em todas as metodologias utilizadas neste trabalho. As amostras comparadas com a referência foram coletadas em outros municípios de Pernambuco (Olinda – A2, Recife – A3, Paulista – A4 e Camaragibe – A5), e submetidas aos mesmos processos de estabilização e extração que a amostra 1, sendo obtidos quatro diferentes extratos brutos para a comparação com a amostra de referência.
Para a realização da CCD-AE, foram utilizadas as mesmas condições utilizadas no fingerprint de polifenois, com aplicação dos padrões: ácido gálico, ácido elágico (taninos hidrolisáveis) e luteolina e kaempferol (flavonoides) e revelação com reagente natural A (NEU) seguido de PEG. Na figura 56 pode ser observado o cromatograma para as diferentes amostras de extrato bruto das folhas de pitanga.
Em relação aos taninos, são evidenciadas bandas azuladas referentes aos padrões de ácido gálico e elágico, bandas correspondentes a estas subtâncias em todas as amostras. As manchas apresentam diferentes intensidades nas amostras, o que indica distintos graus de concentração. O cromatograma torna evidente que as amostras 3 e 5 possuem quantidades menores destas substâncias dado a menor intensidade das bandas relativas a elas.
Neste mesmo cromatograma, são visualizadas bandas relativas aos padrões utilizados para flavonoides. Um heterosídeo, luteolina-7-O-glicosídeo que apresenta coloração amarela/alaranjada e uma aglicona, Kaempferol de coloração esverdeada. Estas substâncias servem de referência, indicando a presença de heterosídeos e agliconas na amostra de acordo com o fator de retenção exibido. Nas amostras é possível identificar bandas relativas aos flavonoides com colorações que variam do amarelo ao laranja, totalizando ao menos 5 bandas com diferentes intensidades. As bandas apresentam Rf distintos, algumas assemelhando-se ao padrão luteolina.
Figura 56 - Fingerprint por CCD-AE para diferentes amostras de extrato bruto de E. uniflora. Revelador: NEU+PEGem 365 nm.
Fonte: Autoria própria.
Através dos resultados obtidos, pôde-se concluir que as amostras apresentaram o mesmo perfil para taninos e flavonoides, evidenciando as mesmas bandas, apenas com diferentes intensidades. Com excessão da amostra 2, que apesar de conter o mesmo perfil, apresenta uma banda amarelada junto ao fronte de eluição, que não foi exibida pelas outras amostras. Além disso, é possível verificar a eficiência da separação dos componentes dos extratos brutos pela CCD-AE. As bandas possuem maior separação e resolução do que a CCD convencional (Figura 57), evidenciando com maior clareza as bandas.
Figura 57 - Fingerprint por CCD convencional para diferentes amostras de extrato bruto de E. uniflora. Revelador: NEU+PEG em 365 nm.
Com o fingerprint por CLAE (Figura 58), foi possível observar similaridades entre as amostras, inclusive comparar tempos de retenção e espectros de varredura das substâncias presentes nas amostras de diferentes localizações. Nesta análise foram encontrados em média 30 picos em comum nas amostras. Além disso, f oram evidenciadas as presenças de ácido gálico, ácido elágico e dos flavonoides 1, 2 e 3, com diferentes concentrações, porém sempre com o mesmo perfil. É possível observar nos cromatogramas, as regiões de similaridades nos intervalos de tempo de 7 -11 min e de 22- 27 min, como o determinado na amostra de referência. Neste sentido, as substâncias encontradas nestes intervalos, foram eleitas como ―picos característicos de fingerprint” nesta espécie, pois representam as principais características apresentadas pelas amostras. Incluindo a presença das substâncias marcadoras (ácido gálico e elágico, além doas flavonoides) (MA et al., 2011; LI et al., 2015).
Como pode ser observado nos cromatogramas, a maioria dos picos evidenciados na amostra de referência também foram observados nas outras amostras. Este achado permite a confirmação das identidades das amostras 2, 3, 4 e 5 como provenientes de folhas de Eugenia uniflora. Comprovando a existência do perfil químico com as mesmas características da amostra de referência. Esta semelhança obtida nos fingerprints por CCD-AE e CLAE podem estar correlacionadas com a origem das amostras, pois as cinco amostras adquiridas para análise foram provenientes de regiões litorâneas do estado de Pernambuco. O que indica que estas amostras possuem praticamente a mesma influência de fatores climáticos, o que acarretou em pequenas variações na produção de metabólitos, as quais não comprometeram o perfil cromatográfico das diferentes amostras de E. uniflora.
Estes resultados apontam que os fingerprints por CCD-AE e CLAE fornecem uma ferramenta simples e útil na identificação de espécies vegetais. Além disso, o perfil químico evidenciado pode fornecer dados para a padronização e suporte às atividades terapêuticas das espécies vegetais.
Assim, diante das diversas atividades farmacológicas da pitangueira relacionadas à presença de taninos e flavonoides, estes fingerprints podem ser considerados como referência no controle de qualidade de matérias primas e derivados vegetais pro venientes das folhas de pitanga.
Figura 58 - Fingerprint por CLAE para difrentes amostras de E. uniflora.
Fonte: Autoria própria.
5.5 FRACIONAMENTO PRELIMINAR DOS CONSTITUINTES DAS FOLHAS DE