1 Introduction
Les Chapitre C-1 et Chapitre C-2 ont mis en évidence une augmentation de la croissance végétale sur les sols contaminés amendés au biochar, en relation avec la baisse de la disponibilité des métaux dans le sol. L h poth se sous-jacente est u e di i ua t la ph todispo i ilit des métaux, le biochar réduit la phytotoxicité. La manifestation du tropisme racinaire vers les zones amendées observée au Chapitre C-2 pour le sol acide serait également directement liée à une baisse de la rhizotoxicité. Au u e tude sp ifi ue a epe da t t e e jus ue là pou a a t ise l effet du
biochar sur la toxicité des sols contaminés aux métaux autrement que par une mesure de croissance végétale.
La croissance végétale étant contrôlée par
d aut es fa teu s, o e la dispo i ilit des
nutriments dans le sol, une mesure plus spécifique de la toxicité pour la plante est nécessaire pour valider l h poth se d u e
diminution de la phytotoxicité du sol par le biochar, via une diminution de la disponibilité des métaux.
Il est gale e t essai e de s assu e ue le
biochar lui-même ne participe pas à la phytotoxicité, notamment à travers sa fraction organique labile (Chapitre A-1).
Linnocuité du biochar a d a o d t v ifi e e utilisa t le io ha pu ou dilu da s du sa le
comme substrat de croissance pour Z. mays et L. sativa. Des essais de mesure de génotoxicité ont ensuite été conduits au LIEC. Ces essais sont fo d s su l o se vatio de micronoyaux dans les cellules issues de coupes de racines secondaires de Vicia faba développées pendant une exposition de quelques jours à des substrats contaminés (Foltête et al. 2012). Les micronoyaux correspondent à
l ADN des o au ellulai es a a t t e do ag suite à des o t ai tes de to i it e e es pa l e vi o e e t. Ces essais o t t appli u s au as des sols o ta i s A et B a e d s au io ha
et d u sol t oi e p se e et e l a se e de io ha . Les esu es de g oto i it o t t
couplées à des mesures de morphologie racinaire, de contenu des métaux dans les racines et
d e t a tio des tau da s les sols pou ta li le lien entre phytotoxicité et diminution de la disponibilité des métaux. Enfin, ces mêmes mesures ont été réalisées sur le biochar pur utilisé comme substrat de croissance pour déceler une génotoxicité causée par le biochar.
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2 Matériel et méthodes
2.1 Tests de germination sur biochar
Des tests de germinationo t t alis s su des la ges de sa le d Hostu et de io ha afi de v ifie l i o uit du biochar sur la germination de deux espèces, la laitue (Lactuca sativa) et le maïs (Zea mays) (voir Chapitre A-2).
Trois substrats sont utilisés : du sa le d’Hostu , employé comme substrat de référence pour la germination, du biochar 1 pur non traité et un mélange composé de 90% en masse de sable et de 10% de biochar 1. Les trois substrats sont testés avec L. sativa, tandis que seul le sable pur et le biochar pur sont testés avec Z. mays. Des boîtes de Pétri carrées en plastique sont remplies de 50 g
de ha ue su st at, ajust à u tau d hu idit po d al suppos opti al % pou le sa le, %
pour le mélange sable-biochar et 180% pour le biochar). Vingt graines sont disposées par boîte. Les
oîtes so t dispos es da s u i u ateu à °C da s l o s u it . Les essais so t alis s e t ipli ats.
Les graines germées sont comptées toutes les 24 h, pendant 8 jours pour L. sativa et 4 jours pour
Z. mays. Dans ce dernier cas, les graines germées sont laissées 3 jours supplémentaires dans les boîtes de Pétri puis les parties aériennes et racinaires du maïs sont séparées, séchées et pesées.
2.2 Tests de génotoxicité
2.2.1 Préparation des substrats
L i flue e des tau et du io ha a t tudi e su la production de micronoyaux dans les racines de fève (Vicia faba). Neuf substrats ont été préparés à pa ti d u sol t oi o o ta i , les deu
sols contaminés A et B (voir Chapitre A-2), et le biochar (Tableau 23). Le sol témoin non contaminé (T) correspond au sol certifié Lufa 2.2, de pH acide et de texture sableuse (Tableau 82 en Annexes). Des pré-essais ont montré que le sol A pur présentait une trop forte toxicité inhibant le développement de racines secondaires. Il a alors été dilué avec le sol témoin T, à 25 et 50 % en
asse. Le sol B a t utilis pu . D ap s les résultats précédents, il devrait exister un gradient de toxicité croissant T < B < A25 < A50.
Tableau 23 : Modalités de substrat retenues pour les tests de génotoxicité. Les nombres indiqués représentent la proportion massique des substrats de base utilisés (%).
Modalité Sol T Sol A Sol B Biochar
T - 0% 100 0 0 0 T - 5% 95 0 0 5 A25 - 0% 75 25 0 0 A25 - 5% 71,25 23,75 0 5 A50 - 0% 50 50 0 0 A50 - 5% 47,5 47,5 0 5 B - 0% 0 0 100 0 B - 5% 0 0 95 5 BC - 100% 0 0 0 100
193 200 g de chaque mélange de sol sont introduits dans trois pots. Dans le cas du io ha seul, l appo t
est réalisé suivant un volume ide ti ue à elui des sols, soit u e asse s he d e vi o g. Les pots sont laissés à incuber pendant 5 jours à 85% de leur capacité au champ respective en chambre de culture à 24 °C.
2.2.2 Croissance et analyses
Exposition des fèves
Des fèves de V. faba sont mises à germer en conditions contrôlées pendant 3 jours sur du coton humide1. Les fèves sont ensuite récupérées et l'apex de la racine principale est
se tio afi de p ovo ue l e ge e de
racines secondaires au contact du substrat d'exposition. Quatre fèves sont alors placées dans chaque pot. Les fèves sont laissées au contact du substrat testé pendant 7 jours en chambre de culture.
Figure 85 : Photographies des pots contenant chacun 4 individus de V. faba après 7 jours d'exposition des racines secondaires
Récolte et analyses
Chaque fève est retirée du substrat avec l'intégralité du système racinaire et traitée individuellement. Les tiges sont séchées à l'étuve à 50°C pendant 72 h. Les racines secondaires sont séparées de la racine principale, lavées à l'eau déionisée et scannées avec le logiciel Winrhizo pour la mesure de la longueur et la surface racinaires en fonction de classes de diamètre spécifiques. Un échantillon moyen de racines est constitué pour chaque pot (1 à 2 racines secondaires de chaque individu) et fixé dans une solution de Carnoy (25% d'acide acétique et 75% d'éthanol) puis conservé dans une solution d'éthanol à 70% avant la réalisation des coupes. Les observations des cellules des racines secondaires sont conduites3 suivant la procédure suivante (Foltête et al. 2012) : les racines sont rincées à l'eau distillée, hydrolysées avec HCl 1N à 60 °C pendant 6 min, déposées sur une lame et colorées avec de l'acéto-orcéine à 1 %. Les micronoyaux et les cellules en mitose sont dénombrés au microscope sur un total de 1 000 cellules pour chaque racine sous un grandissement x 40. L'indice mitotique est exprimé par le nombre de cellules en division sur 100 cellules observées.
Le reste des racines est lavé une nouvelle fois à l'eau déionisée et passé aux ultrasons, puis séché à l'étuve à 50°C pendant 72 h. Les masses des racines secondaires sèches et des tiges sèches sont mesurées pour chaque individu. Les racines sont ensuite broyées puis minéralisées par le protocole Digiprep. Les éléments présents dans la solution sont dosés par ICP-AES (Chapitre A-2). Les sols de chaque pot sont séchés à 50°C pendant 72 h, puis le pH et les éléments extractibles au CaCl2 0,01M sont mesurés (Chapitre A-2).
1 La germination et l'exposition des fèves aux substrats se sont déroulées au Laboratoire Interdisciplinaire des Environnements Continentaux (LIEC) à Metz. 2 La récolte des plantes est réalisée au Laboratoire Sols et Environnement (LSE) à Nancy. 3 Les observations micrsoscopiques sont réalisées au LIEC à Metz
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3 Résultats
3.1 Tests de germination sur biochar
L'évolution du taux de germination de L. sativa et Z. mays est identique suivant la présence ou non de biochar (Figure 86). La biomasse de Z. mays à 7 jours est en revanche 2 fois inférieure après l'exposition au biochar 1 pur qu'après celle au sable témoin (Racinaire : 37 mg contre 63 mg ; Aérienne : 24 mg contre 51 mg).
L. sativa : Z. mays :
Figure 86 : Suivi du taux de germination des graines de L. sativa pendant 8 jours et de Z. mays pendant 5 jours. Losange gris : Sable témoin ; Carré gris : Sable + 10 % de biochar 1 ; Carré noir : 100 % de biochar 1. Les barres d'erreurs représentent l'erreur standard.
3.2 Tests de génotoxicité sur sols contaminés et biochars
3.2.1 Croissance
La présence de biochar dans le sol A dilué conduit à une augmentation importante de la masse de racines secondaires, de leur longueur et leur diamètre (Figure 87 et Tableau 83 en Annexes). Cet
effet bénéfique du biochar est d'autant plus marqué que la proportion du sol A est élevée (A25 < A50). Il n'y a pas de différence significative avec le sol B pour ces paramètres. La masse de racines secondaires et la longueur racinaire sont minimales en présence du biochar pur et équivalentes à celles mesurées sur le substrat le plus toxique (A50-0%). La biomasse aérienne ne varie pas significativement entre les différents traitements, excepté avec le biochar pur qui entraîne une
production de biomasse aérienne significativement plus faible. Le rapport parties aériennes/racines est minimal avec les fèves exposées au biochar pur (Figure 88). Il diminue lorsque le biochar est présent dans les sols contaminés.
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3.2.2 Mitose et génotoxicité
L'indice mitotique mesuré dans les cellules racinaires diminue suivant le gradient de toxicité métallique des sols (T < B < A25 < A50) (Figure 88). L'indice mitotique augmente avec l'apport de biochar dans les sols (non significatif pour le sol témoin et le sol B). L'indice mitotique mesuré sur les racines au contact du biochar 1 pur est équivalent à celui des racines exposées au sol B non amendé. La fréquence d'occurrence de micronoyaux augmente significativement suivant le gradient de toxicité des sols (T < B < A25 < A50) (Figure 88). L appo t de io ha sur les trois sols contaminés
provoque une diminution significative de la fréquence des micronoyaux par rapport à chacun des sols non amendés. La fréquence de micronoyaux est minimale dans les cellules des racines secondaires exposées au biochar pur.
3.2.3 Prélèvement d'éléments
La concentration du Zn et du Cu dans les racines secondaires augmente suivant le gradient de toxicité des sols (T < B < A25 < A50) (Figure 89 et Tableau 84 en Annexes). L'apport de biochar permet de diminuer la concentration racinaire de ces métaux (non significatif pour le sol T et B). Avec Cd et Pb, les différences sont faibles suivant l'absence ou la présence de biochar dans les sols contaminés. La concentration du Ca dans les racines secondaires augmente significativement avec les apports de biochar au sol A (A25, A50) mais diminue significativement dans le cas du sol B (Tableau 84 en
Annexes). Les concentrations en K et Mg augmentent significativement avec l'apport de biochar sur le sol témoin. L'apport de biochar sur le sol A50 conduit à une diminution significative de la concentration de P dans les racines secondaires.
3.2.4 pH des substrats et éléments extractibles
Le biochar conduit à une augmentation significative du pH de chacun des sols testés (Tableau 84 en
Annexes). Le pH est maximal dans le cas du biochar pur. Les teneurs extractibles de Cd, Pb et Zn dans les sols après exposition des fèves augmentent suivant le gradient de toxicité des sols (T < B < A25 < A50). L’appo t de io ha di i ue les quantités extractibles de Cd, Cu, Ni, Pb et Zn.L appo t de
biochar à chacun des sols conduit à une augmentation significative du K extractible, et, dans une moindre mesure, du Mg extractible. Le Na extractible augmente également en présence de biochar, sauf dans le cas du sol A50. Les teneurs extractibles en Fe dans les sols diminuent avec les apports de biochar et sont nulles dans le cas du biochar pur.
3.2.5 Corrélations entre paramètres
Les relations entre l’indice de mitose, la fréquence de micronoyaux et la longueur ou la surface racinaire développées sont linéaires (R2 > 0,99) lorsque l'on considère uniquement les quatre substrats testés contenant le sol A. L'indice de mitose diminue en proportion avec l'augmentation de la teneur en Zn et Pb extractible dans le substrat (r -0,95) et avec l'augmentation de la teneur en Zn dans les racines secondaires (r = -0,95), tandis que la fréquence des micronoyaux augmente avec Zn et Pb extractible (r , ai si u'ave la o e t atio de ) da s les a i es r = 0,95).
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196 Figure 87 : Masses individuelles de tige (en haut) et de racines secondaires (au milieu) et surface des racines secondaires (en bas) développées par V. faba après 7 j d'exposition à différents substrats. BC : biochar pur ; T : sol témoin ; A25 : A mélangé à 25 % dans T ; A50 : A mélangé à 50% avec T. Les barres d'erreurs correspondent à l'erreur standard. Différentes lettres indiquent des différences significatives (Student-Newman-Keuls, p < 0,05).
197 Figure 88 : Ratio massique aérien/racinaire (en haut), fréquence de division cellulaire (au milieu) et fréquence de micronoyaux (en bas) développées par V. faba après 7 j d'exposition à différents substrats. BC : biochar pur ; T : sol témoin ; A25 : A mélangé à 25 % dans T ; A50 : A mélangé à 50% avec T. Les barres d'erreurs correspondent à l'erreur standard. Différentes lettres indiquent des différences significatives (Student-Newman-Keuls, p < 0,05).
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198 Figure 89 : Concentration de Cd (en haut), Pb (au milieu) et Zn (en bas) dans les racines secondaires de V. faba après 7 j d'exposition à différents substrats. BC : biochar pur ; T : sol témoin ; A25 : A mélangé à 25 % dans T ; A50 : A mélangé à 50% avec T. Les barres d'erreurs correspondent à l'erreur standard. Différentes lettres indiquent des différences significatives (Student-Newman-Keuls, p < 0,05).