À travers les travaux présentés dans ce mémoire, nous avons démontré que dans les cellules musculaires lisses humaines d'artère carotide, des facteurs de croissance comme PDGF et des cytokines pro-inflammatoires comme TNF activent le facteur de transcription HIF-1 par la voie PI3K/Akt/GSK3|3. Comme dans les cellules cancéreuses, l'activation de HIF-1 augmente la glycolyse par la hausse de l'expression de l'enzyme hexokinase II et hyperpolarise le potentiel de membrane mitochondriale par la translocation de l'hexokinase II à la mitochondrie, supprimant ainsi l'habilité des cellules musculaires lisses vasculaires à entrer en apoptose et promouvant leur prolifération (Lambert et al., 2010). Dans un modèle in vivo d'angioplastie de l'artère carotide chez le rat, nous avons démontré que l'inhibition de HIF-1, de façon directe localisée ou de façon indirecte par l'inhibition systémique de TNF avec l'inhibiteur de TNF PEGsTNFRl, prévient le remodelage de l'artère carotide post-chirurgie en diminuant la prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses d'artère carotide.
Plusieurs études ont montré que PDGF active HIF-1 promouvant ainsi la prolifération et la résistance à l'apoptose des CMLV dans les MVR, caractéristiques similaires aux cellules cancéreuses (Schultz et al., 2006, Bonnet et al., 2006, Bonnet et al., 2009). Comme le facteur de transcription HIF-1 a des implications dans les fonctions mitochondriales (promeut l'hyperpolarisation du potentiel de membrane mitochondriale) (Bonnet et al., 2006), le métabolisme glycolytique cellulaire (régule l'expression de plusieurs enzymes glycolytiques incluant l'hexokinase II), l'apoptose et la prolifération cellulaire, celui-ci pourrait expliquer pourquoi les CMLV ont des caractéristiques semblables aux cellules cancéreuses. En effet, similairement à l'effet Warburg dans les cellules cancéreuses, les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération sont caractérisées par une hausse de la glycolyse anaérobique causant une hausse de production de lactate, et ce malgré des niveaux normaux d'oxygène (Warburg, 1956a, Kim and Dang, 2006). En accord avec nos découvertes chez les cellules musculaires lisses, Pastorino et al (Pastorino et al., 2005) ont précédemment montré que ces caractéristiques chez les cellules cancéreuses résultaient en l'activation de la voie Akt, favorisant la translocation
mitochondriale de l'hexokinase II (Semenza, 2001), inhibant ainsi l'oxydation du glucose et l'apoptose des cellules. Fait intéressant, de précédentes études ont montré que la voie Akt (Gordan et al., 2008, Lau et al., 2009) ainsi que le lactate permettent l'activation de HIF-1 dans les cellules cancéreuses (Lu et al., 2002, McFate et al., 2008), renforçant les similarités entre celles-ci et les CMLV prolifératives. Nos résultats pourraient apporter une meilleure explication de l'efficacité de certains modulateurs métaboliques comme le dichloroacetate (DCA) (Bonnet et al., 2007a, Xiao et al. 2010, Michelakis et al., 2002) dans le traitement des maladies vasculaires comme l'hypertension artérielle pulmonaire (Bonnet et al., 2006, Guignabert et al., 2009). Le DCA bloque les enzymes pyruvate déshydrogénase kinases, forçant le pyruvate à entrer dans le cycle de Krebs, diminuant ainsi la génération de lactate et l'activation de HIF-1. En plus de réguler la glycolyse, celui- ci régule le métabolisme des acides gras en ciblant le récepteur nucléaire PPARy où son expression et son activité ont été montrées comme augmentées dans les MVR et associées à la prolifération (Krishnan et al., 2009, Rabinovitch, 2010, Meredith et al., 2009). En plus de PPARy, une étude du groupe de Sutendra a montré que l'inhibition de l'enzyme MCD, enzyme clé du métabolisme des acides gras, diminuait le remodelage dans un modèle animal d'HTAP (Sutendra et al., 2010). En diminunant le métabolisme des gras, il se produit un transfert de production d'énergie par l'augmentation de l'activité de la PDH et augmente l'oxydation du glucose dans la mitochondrie. Cette balance énergétique a été appelée cycle de Randle.
Comme chez les cellules cancéreuses, nous avons montré dans notre modèle de MVR que l'activation de HIF-1 par le facteur de croissance PDGF ou la cytokine TNF est dépendante de l'activation de l'axe PI3K/Akt/GSK3fî et que l'inhibition de cet axe diminue l'activation de HIF-1. En effet, en utilisant l'inhibiteur de la voie PI3K LY294002 en présence de PDGF ou de TNF, l'activation de HIF-1 était fortement diminuée et par conséquent diminuait la prolifération et augmentait l'apoptose des CMLV. Ces résultats sont d'un grand intérêt quant à la compréhension des mécanismes d'action de certains inhibiteurs largement utilisés de la voie PI3K/Akt dans le traitement contre le cancer (Collins, 2009) et les maladies cardiovasculaires (Choi et al., 2010). Par exemple, notre groupe de recherche a récemment montré que la molécule déhydroepiandrosterone (DHEA) traite le remodelage vasculaire des artères pulmonaires en passant par l'inhibition de la voie
Akt, résultant en une diminution de la résistance à l'apoptose dépendante de l'hexokinase II (Bonnet et al., 2009). Ces découvertes concordent avec nos résultats que l'activation de HIF-1 est une nouvelle voie de liaison entre l'activation de Akt et l'augmentation d'expression de l'hexokinase II amenant une résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses vasculaires. Les effets de la DHEA sur l'inhibition de Akt pourraient avoir un intérêt thérapeutique (Bonnet et al., 2009), car d'une part la molécule a un potentiel clinique intéressant dû à sa non-toxicité et à son faible coût de production et d'autre part pourrait expliquer l'inhibition de HIF-1 dans la circulation pulmonaire (Debonneuil et al., 2006). La régulation de l'apoptose serait donc une cible potentielle dans le traitement des MVR et dans le contrôle des dommages aux organes (deBlois et al., 2005).
Dû aux nombreux médiateurs impliqués dans les maladies vasculaires à remodelage, il est fort probable que d'autres mécanismes en plus de la voie Akt peuvent expliquer en partie nos résultats. En effet, les effets des facteurs de croissance et les cytokines qui occasionnent le remodelage vasculaire (Peppel et al., 2005, Kurobe et al., Baluk et al., 2009) sont médiés par l'activation de récepteur tyrosine kinase, lequel peut activer différentes voies en aval incluant Akt, STAT3, N F K B , Src ou le facteur nucléaire KLF5
«Kruppel-like factor 5» (Choi et al., Chao et al., 2007, Kim et al., 2008, Suzuki et al., 2009). Par exemple, les effets du TNF ont été montrés comme étant médiés par les voies Jak/STAT et NFKB (GUO et al., 1998, Wajant et al., 2003, Zimmerman et al., 2002).
Toutes les voies d'activation passent par les récepteurs du TNF soient TNFR1 et TNFR2, qui sont présents dans les CMLV d'artère carotide dans nos modèles in vitro et in vivo. La voie du TNFR1 a été associée avec l'activation de voies pro-apoptotiques, alors que TNFR2 l'a été avec des voies prolifératives (Wajant et al., 2003). Dans notre étude, nous avons montré une augmentation d'expression de TNFR2, ce qui est cohérent avec nos phénomènes observés, renforçant l'importance de TNF dans le remodelage vasculaire. En plus d'Akt, ces autres médiateurs peuvent aussi activer HIF-1 (Xu et al., 2005), promouvant la résistance à l'apoptose (Lau et al., 2009) et la prolifération des cellules (Kim et al., 2008, Chao et al., 2007, Peppel et al., 2005). Cependant, il a été reconnu que peu importe la voie de signalisation menant à l'activation des HIF-1 dans les CMLV, celles-ci verront leur prolifération augmentée et seront résistantes à l'apoptose. Ceci renforce
l'importance de HIF-1 dans le remodelage vasculaire et le présente clairement comme cible thérapeutique dans les maladies vasculaires comme le suggère les résultats de notre modèle in vivo et de données montrées précédemment (Karshovska et al., 2007, Bonnet et al., 2006).
En plus de leur résistance à l'apoptose, les maladies vasculaires à remodelage sont associées avec une augmentation de la prolifération des cellules musculaires lisses démontrée dans les présents travaux. Dans les études passées de notre laboratoire, nous avons bien démontré le mécanisme engendrant la prolifération des cellules musculaires lisses dans les maladies vasculaires à remodelage. En effet, nous avons montré que la prolifération impliquait une diminution d'expression des canaux K+ (Kv1.5) résultant en
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une dépolarisation des cellules, une activation de canal Ca de type L augmentant la [Ca2+]i, promouvant ainsi l'activation du facteur de transcription NFAT (Bonnet et al.,
2006, Shimoda et al., 2001, Karshovska et al., 2007). Dans les présents travaux, nous avons montré que l'inhibition de HIF-1 diminue la prolifération des cellules musculaires lisses d'artère carotide. Ces résultats sont en accord avec ce qui a été montré précédemment incluant ceux qui ont été démontré dans le laboratoire, à savoir que l'activation de HIF-1 compte dans la diminution de l'expression des canaux K+, particulièrement les canaux
Kv1.5. Cependant, en bloquant HIF-1, l'expression des canaux K+ est promue, diminuant
ainsi la [Ca2+]j et la prolifération (Bonnet et al., 2006, Shimoda et al., 2001). Étant donné
que notre groupe de recherche a déjà publié sur l'implication de HIF-1 dans la prolifération des cellules musculaires lisses et sur la diminution de l'expression de Kv1.5 dans les
cellules d'artère carotide humaines traitées au PDGF (Bonnet et al., 2009), l'effet de l'inhibition de HIF-1 sur la prolifération des CMLV présenté dans le mémoire a été limitée aux essais PCNA «proliferating cell nuclear antigen» et Ki-67, 2 protéines présentes lors de la prolifération cellulaire. En accord avec nos études, le groupe de Karshovska (Karshovska et al., 2007) a précédemment montré qu'une inhibition spécifique de HIF-1 à l'aide d'un ARN interférence inhibait significativement la croissance de la couche néointimale dans un modèle d'angioplastie de l'artère carotide chez des souris exprimant la cytokine SDF-1 «stromal-derived factor-1». En plus de diminuer la prolifération des CMLV et leur résistance à l'apoptose comme nous avons montré, le groupe a démontré que la réduction de l'aire de la néointima par l'inhibition de HIF-1 était attribuable à une diminution de
l'accumulation de cellules musculaires lisses secondaires à la diminution d'expression de HIF-1 dans la voie SDF-1. Par ailleurs, la diminution du nombre de cellules musculaires lisses d'une aire donnée par l'inhibition de HIF-1 a aussi été montrée dans notre modèle animal. Malgré que les effets de l'inhibition de HIF-1 sur SDF-1 n'ont pas été testés dans nos travaux, l'étude de Karshovska amène un mécanisme additionnel démontrant que l'inhibition de HIF-1 pourrait avoir un bon intérêt thérapeutique dans le remodelage vasculaire.
Les mécanismes amenant les taux élevées de TNF dans les MVR sont encore inconnus, mais sont d'un grand intérêt clinique. Une découverte a été apportée par notre laboratoire et pourrait en partie expliquer cette hausse. Nous avons précédemment montré que NFAT est augmenté dans les maladies vasculaires à remodelage (Bonnet et al., 2009, Bonnet et al., 2007b). Comme l'expression de TNF est connue pour être médiée en partie par NFAT, nous avons spéculé que son activation pouvait induire l'augmentation du TNF chez des patients ayant des maladies vasculaires à remodelage. Cette hypothèse est en accord avec nos découvertes publiées précédemment montrant que l'inhibition de NFAT renverse ces maladies en diminuant la phosphorylation d'Akt, la prolifération et la résistance à l'apoptose des CMLV (Bonnet et al., 2007b, Bonnet et al., 2009).
En plus d'entraîner la diminution d'activation de HIF-1, l'inhibition de TNF dans les MVR engendre d'autres mécanismes contribuant à la diminution du remodelage des artères. En effet, de plus en plus d'études démontrent que l'inhibition de TNF dans les MVR occasionne une régénération plus rapide des cellules endothelials de la couche intimale d'une artère qui ont souvent été détruites par une angioplastie ou qui présentent une dysfonction. Récemment, le groupe de Kerekes (Kerekes et al., 2009) a montré que l'inhibition de TNF améliore la regénération des cellules endothelials en augmentant le nombre et la différenciation de cellules progénitrices de 1'endothelium. Dans notre modèle, nous avons des données préliminaires qui montrent que l'inhibition de TNF par la molécule PEGsTNFRl améliore la réparation des cellules endothelials montrée à la figure 4.1. En effet, les animaux traités au PEGsTNFRl présentent un plus grand nombre de cellules endothelials comparativement aux rats traités à une solution saline, marquées par l'augmentation du nombre de cellules positives au facteur Von Willebrand (en rouge), qui
est une molécule synthétisée par les cellules endothéliales. Il aurait été intéressant de savoir par contre si la diminution du remodelage entraînée par une inhibition directe de HIF-1 permet une régénération plus rapide des cellules endothéliales, car celles-ci sont importantes dans le processus d'angiogénèse (Lamalice et al., 2007).
Angioplastie (14 jours) Sham actine U20) Facteur Von Willebrand (x20) Merge +DAPI (x80) Saline PEGsTNFRl
Figure 4.1 : Présence d'endothélium dans les artères carotides de rats traités au PEGsTNFRl
Les cellules endothéliales sont présentes dans les carotides traitées au PEGsTNFRl et non dans celles traitées à la saline après 14 jours d'angioplastie. L'endothelium est montré par un triple marquage avec le facteur Von Willebrand (rouge), Vactine des CMLV (green) et le marqueur nucléaire DAPI (n=3 par groupe).
Le choix de l'utilisation de la cytokine TNF dans notre modèle vient du fait que de plus en plus d'études montrent son implication dans les maladies cardiovasculaires. Par exemple, des taux élevés de TNF dans la circulation ont été associés à une augmentation du risque de développer des maladies vasculaires (Kritchevsky et al., 2005). Aussi, une expression excessive du TNF chez des souris ayant développées l'hypertension artérielle pulmonaire présentent une aggravation de leur état (Fujita et al., 2001). De plus, dans un récent rapport de cas, l'anticorps contre TNF infliximab réduit les pressions pulmonaires et augmente la qualité de vie des patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire secondaire à une sclerodermic (Bargagli et al., 2008). Nos résultats présentés dans le 2e article confirment l'implication du TNF dans les maladies vasculaires à
En plus de TNF, d'autres agonistes ou peptides tel que l'angiotensine II induisent l'expression de HIF-1 dans les CMLV et peuvent participer à la formation du remodelage des artères dans les MVR. Dans ces pathologies, il a été démontré que l'expression de ce peptide est augmentée, ce qui en fait une bonne cible thérapeutique. Pusieurs groupes ont étudié l'effet de l'inhibition de l'angiotensine II sur la formation du remodelage des vaisseaux. Entre autres, un groupe a démontré que l'utilisation du losartan, un antagoniste de l'angiotensine II, induisait l'apoptose dans la couche néointimale d'un modèle animal de MVR de l'aorte chez le rat (Lemay et al., 2009).
Finalement, après avoir démontré l'implication de HIF-1 dans les CMLV d'artère carotide humaine, nous avons montré pour la première fois qu'il est impliqué dans le remodelage vasculaire dans un modèle d'angioplastie de l'artère carotide chez le rat et qu'il peut être thérapeutiquement ciblé. Par conséquent, dans un premier temps, nous proposons qu'une inhibition localisée de HIF-1 puisse être une nouvelle stratégie thérapeutique pour prévenir le remodelage des maladies vasculaires. De plus, dans les travaux présentés, l'inhibition de HIF-1 ainsi que la régénération de cellules endothéliales, qui sont deux phénomènes participant à la diminution du remodelage des MVR et provoqués par l'inhibition de TNF, pourrait amener des inhibiteurs de TNF, utilisés déjà dans le traitement de maladies autoimmunes, à être utilisés dans le traitement des maladies vasculaires à remodelage. Le bénéfice pourrait être maximal chez des patients qui ont des maladies vasculaires associées à une maladie autoimmune, particulièrement ceux qui ont des taux élevés de TNF. Nous proposons donc dans un deuxième temps que le développement de stent permettant un relarguage lent d'inhibiteurs de TNF pourrait devenir une stratégie thérapeutique de choix dans la prévention de la resténose de l'artère carotide.