EFFET DE LA BMP-2 ET/OU DE LA BMP-9 SUR DES PRÉOSTÉOBLASTES ATTACHÉS À DU
6. CHAPITRE 6 : CONCLUSION ET PERSPECTIVES
6.1. Conclusion
Tout d ’abord ce projet de doctorat a perm is de fonctionnaliser un film PC L p a r un peptide d ’adhésion pR G D via une cystéine et d ’étudier son influence sur la réponse de préostéoblastes m urins M C3T3-E1 à la B M P-2. Si, en absence de sém m , l ’auto-activation de la FA K et la stim ulation de la voie canonique des Sm ads par la BM P-2 ont uniquem ent été observées dans les cellules adhérant au PC L -pR G D , ce projet de doctorat a néanm oins m ontré com m ent les protéines adhésives contenues dans le sérum pouvaient com plètem ent m asquer l’effet de cette fonctionnalisation en term es d ’organisation du cytosquelette. Les résultats obtenus avec les pR G D et pR G E sont en effet dans ce cas sim ilaires. Cette étude rappelle donc l ’im portance d ’u tiliser des peptides négatifs contrôles (pR G E ) qui sont pourtant souvent négligés dans la littérature. L ’absence d ’activation des Sm ads dans les préostéoblastes M C3T3-E1 au contact du PC L-pR G E sem blent confirm er le rôle clé des intégrines, dont a vp, dans la réponse cellulaire à la B M P-2. M alheureusem ent, les peptides négatifs n e sont pas utilisables pour des expériences à long term e, la survie des préostéoblastes étant drastiquem ent affectées.
D ans un deuxièm e tem ps, ce projet a m ontré que les activations des voies Sm ad et W nt canonique dans les préostéoblastes adhérant au PC L -pR G D en présence de B M P-2 et B M P-9 étaient très différentes. Ces résultats suggèrent que la BM P-2 et la BM P-9, issues de deux sous-fam illes de B M P, ne font pas intervenir les m êm es régulations dans les préostéoblastes M C3T3-E1 au contact de film s PC L-pR G D . A insi, la différenciation des préostéoblastes induite par la co-stim ulation BM P-2 et B M P-9 s ’avère décevante par rapport à l ’utilisation de B M P-2 seule.
L ’étude m enée dans ce projet m et donc en avant l’im portance des choix à faire en term es de fonctionnalisation et de stim ulation p a r des facteurs de croissance. E n effet, la
fonctionnalisation peut induire une signalisation contradictoire p ar différents B M Ps. Il est donc im portant de quantifier chaque phénom ène avant l’utilisation finale aussi bien en ingénierie tissulaire que dans le cadre d ’im plantation de biom atériaux.
En conclusion, les résultats obtenus dans ce projet ont perm is d ’acquérir une m eilleure com préhension des événem ents biochim iques im pliqués lors de l ’utilisation des B M Ps en com binaison avec un biom atériau fonctionnalisé p ar des peptides d ’adhésion. C ependant, cette étude utilise des cellules qui sont déjà orientées dans la lignée ostéogénique. Il serait alors fort intéressant à plus long term e de déterm iner quelles sont les répercussions d ’un tel systèm e sur les cellules souches m ésenchym ateuses.
6.2. Perspectives
Ce projet de doctorat avait com m e principal o b jec tif de m ieux com prendre l ’influence d ’un m atériau fonctionnalisé p ar des peptides d ’adhésion sur la réponse cellulaire aux B M Ps et plus précisém ent à la B M P-2 et à la B M P-9. C ependant cette étude ouvre u n certain nom bre d ’interrogations et le systèm e dem ande certaines am éliorations.
6.2.1. Favoriser l ’interaction cellule/PC L -pR G D
U n point im portant dans le cadre des surfaces fonctionnalisées est la densité des peptides qui peut jo u e r sur l’adhésion, la prolifération et la différenciation des cellules au contact du m atériau. Par exem ple, la prolifération des préostéoblastes M C3T3-E1 dépend de la densité de peptides présents sur la surface alors que les cellules souches m urines (cellule D l) sont m oins affectées (H siong et al., 2008). Il sera donc im portant de quantifier la densité de peptides présents à la surface du PC L dans notre systèm e. A fin de déterm iner la concentration en pR G D , il est possible de m arquer le peptide avec un agent radioactif ou fluorescent et de com parer les résultats obtenus avec un standard. Il est égalem ent possible de quantifier le groupem ent PD EA partant lors du greffage du pR G D par détection de la fluorescence ou en U V -visible. D es essais prélim inaires en fluorescence n ’ont pas perm is de déterm iner avec précision la densité de pR G D sur le PC L, les quantités de peptides sur la surface étant très faibles (environ 1 pm ol/cm ).
D ans un second tem ps, nous avons vu que l’adsorption protéique non spécifique sur le film de PC L pouvait être problém atique. En effet la fonctionnalisation p a r le pR G D et celle par le pR G E induisent la m êm e organisation du cytosquelette d ’actine des préostéoblastes M C3T3-E1 en présence de sérum . Pour perm ettre une utilisation directe du m atériau fonctionnalisé in vivo il devient indispensable de prévenir cette adsorption protéique non spécifique.
L ’utilisation de polym ères com m e le PEG peut alors être envisagée (Lee et al., 2013). M ichel et al. (2005) ont ainsi m ontré que la densité du PE G est u n facteur dom inant dans la prévention de l ’adsorption non spécifique des protéines. L a fonctionnalisation d ’une surface de pentoxyde de niobium avec un copolym ère de poly(L -lysine)-g-P E G (PL L -g-PE G ) a m ontré que plus la quantité de PEG est im portante dans le copolym ère P L L -g-P E G m oins ce dernier adsorbe les protéines à sa surface (M ichel et a l , 2005). D e plus, la longueur de chaine du PEG est égalem ent un facteur im portant sur les phénom ènes d ’adsorption protéique. Plus les chaines de PEG sont longues (400 < M n < 2000 g/m ol) m oins le polyuréthane fonctionnalisée par ces chaines adsorbe de protéines à sa surface (Chen et a l , 2008).
6.2.2. Favoriser les interactions intégrines/B M P
Ce projet a m is en avant une différence de signalisation entre la B M P -2 et la B M P-9 sur une surface utilisant un peptide d ’adhésion interagissant avec l’intégrine a vp3. D écrypter
l ’interaction des récepteurs intégrines avec ceux de la B M P-9 est le point le plus im portant afin de m ieux com prendre com m ent la B M P-9 interagit avec la cellule afin d ’accroitre l’efficacité des futurs m atériaux fonctionnalisés. Il pourrait être alors intéressant de tester l ’interaction de la B M P-9 avec une autre intégrine, notam m ent l ’intégrine asPi spécifique de la fibronectine. En effet, Tian et a l (2012) ont observé sur les cellules endothéliales que la fibronectine, p a r l ’interm édiaire de ses interactions avec les intégrines a 5Pi, perm ettait une m eilleure signalisation de la B M P-9 via une augm entation de la phosphorylation des S m a d l/5 /8 par rapport à la B M P-9 en présence de collagène seule. Une autre alternative serait l’utilisation de séquences d ’acides am inés m im ant plusieurs sites d ’adhésion avec les intégrines et perm ettant une m eilleure interaction sur la surface PCL. En effet, les protéines de l ’EC M possèdent plusieurs sites actifs. P ar exem ple, la fibronectine im plique les deux séquences R G D et PH R SN lors de son interaction avec l’intégrine a 5Pi (R edick et a l , 2000).
6.2.3. C om prendre les interactions W nt/B M P
D ans les préostéoblastes M C 3T3-E1 adhérant au PC L-pR G D , une différence im portante entre la signalisation intracellulaire de la BM P-2 et la BM P-9 est apparue : en présence de B M P-9, la P-caténine disparait progressivem ent tandis que la phosphorylation des S m a d l/5 /8 débute. A fin d ’étudier l ’influence de la P-caténine sur l’action de la B M P-9, une stim ulation des cellules p ar W nt3a (100 ng/m L ) a été utilisée (Figure 6.1).
Les im m unobuvardages de type w estern révèlent que les préostéoblastes m urins adhérant au PC L -pR G D et stim ulés p a r la B M P-9 pendant 3h puis traités p a r la W nt3a possèdent encore de la P-caténine (Figure 6.1.). L ’ajout de W nt3a a donc partiellem ent inhibé la dégradation de la protéine induite par le traitem ent des cellules p a r la B M P-9.