A Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC), uma das várias técnicas de cromatografia líquido-líquido baseada na partição entre duas fases imiscíveis, tem sido bastante utilizada para o isolamento de produtos naturais, principalmente de origem vegetal, desde o seu desenvolvimento através de uma parceria entre a Sanki. Eng. Ltd. e o Dr. Yochiro Ito (inventor da cromatografia em contracorrente) e a sua introdução no Japão em 1982 (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017; FRIESEN et al., 2015; SKALICKA-WOŹNIAK; GARRARD, 2015; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA-BROCH, 2009; MARCHAL; LEGRAND; FOUCAULT, 2003).
A CPC é uma separação em contracorrente do tipo hidrostática, isto é, o rotor (figuras 1 e 2) é composto por uma série de células que giram em torno de um único eixo (FRIESEN et al., 2015; KȨDZIERSKI; KUKUŁA-KOCH; ŁGOWNIAK, 2014). Como toda técnica em contracorrente, a CPC baseia-se na separação de substâncias entre dois líquidos imiscíveis, um funciona como fase estacionária, retido dentro da coluna devido a força centrífuga gerada pelo rotor em movimento, e outro como fase móvel, bombeado através da fase estacionária (FRIESEN et al., 2015; BERTHOD et al., 2009; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA- BROCH, 2009; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006). Devido a isso e de acordo com as características da amostra, o Cromatógrafo de Partição Centrífuga, pode operar em dois modos (figura 3): ascendente, quando a fase móvel é a fase menos densa, ou descendente, quando a fase móvel é a fase mais densa (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017; KȨDZIERSKI; KUKUŁA-KOCH; ŁGOWNIAK, 2014).
Figura 1 – Estrutura do rotor.
Capítulo 2 - Estudo Fitoquímico de Bryophyllum pinnatum
Júlia Morais Fernandes Figura 2 – Células e ductos dentro do rotor do CPC.
Fonte: BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
Figura 3 – Modos de operação do CPC. Modos ascendente e descendente.
Fonte: Adaptado de BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
Na CPC, as substâncias são separadas de acordo com o seu coeficiente de partição ou distribuição (KD), isto é, na sua distribuição relativa entre as fases móvel e estacionária do
sistema solvente, sendo que as que tem mais afinidade pela fase móvel eluem primeiro (KD <
1), e os que tem mais afinidade pela fase estacionária (KD > 1) são retidos por mais tempo na
coluna, e poderá ser “extrusado”, um mecanismo indisponível para cromatografia líquida baseada em uma fase sólida (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017; LIU et al., 2015; ABDELLAOUI et al., 2010; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006). Dessa forma, o KD é um
parâmetro invariante de qualquer analito em um sistema solvente particular e um parâmetro característico importante em um experimento de separação em contracorrente. (LIU et al., 2015). É importante acrescentar que a “extrusão” é uma das vantagens da técnica de CPC, ou seja, poder recuperar todo o extrato ou fração que foi injetado no equipamento, assim, retirando os compostos que ficam retidos pelo bombeamento da fase estacionária da coluna no final da corrida de eluição. O esquema de separação que ocorre dentro do CPC pode ser visualizado na figura 4.
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Júlia Morais Fernandes Figura 4 – Modus operandi das técnicas de separação em contracorrente do tipo hidrostática, como a CPC.
Fonte: Adaptado de BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017.
A escolha do solvente apropriado é fundamental para separações em contracorrente e pode requerer um investimento de tempo significante que pode ocupar 90 % do tempo destinado a realizar a separação (PAULI; PRO; FRIESEN, 2008). Uma sistemática bastante utilizada para a escolha do sistema bifásico de solventes consiste em preparar a mistura de solventes em pequena escala (tubos de ensaio), agitar e, depois de atingir o equilíbrio, separar as fases.
Então, uma pequena quantidade de amostra (cerca de 1 a 4 mg) é pesada em um tubo de ensaio e é adicionado um pequeno volume de cada fase (2 a 4 mL) ao tubo. Após agitar vigorosamente o tubo de ensaio (cerca de 1 a 2 min), para que ocorra a distribuição do(s) analito(s) entre as fases, as mesmas serão separadas, secas sob pressão reduzida e, analisadas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) (BIANCHI et al., 2018; MANDOVA et al., 2017; DESTANDAU et al., 2015; FRIESEN et al., 2015; BERTHOD et al., 2009; BERTHOD; RUIZ-ÁNGEL; CARDA- BROCH, 2009; MARSTON; HOSTETTMANN, 2006; MOREL et al., 2012). Para análise por CCD, um sistema ótimo fornece uma distribuição igual entre as duas fases e valores de Rf dos componentes da amostra entre 0,2 e 0,5. Para análise por CLAE, a área do pico de cada componente nas diferentes fases (superior e inferior) são comparadas (PAULI; PRO; FRIESEN, 2008).
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Atualmente, com o avanço da tecnologia, as técnicas de separação em contracorrente, especificamente no caso dessa revisão, a CPC, podem ser acopladas a diferentes detectores de modo a acompanhar a separação. O detector mais comumente utilizado é o Ultravioleta-Visível (UV-Vis), no entanto, uma ampla gama de compostos não pode ser visualizada. Devido a isso, diversos outros detectores vem sendo acoplados de forma a garantir um melhor acompanhamento da separação dos compostos, como o ELSD (Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo), EM (Espectrometria de Massas) e até mesmo, em equipamentos mais avançados, o RMN (Ressonância Magnética Nuclear) (MICHEL; DESTANDAU; ELFAKIR, 2014).
A técnica de CPC vem ganhando popularidade como um método de separação para produtos naturais, embora a técnica de HSCCC (High Speed Counter-Current Chromatography – Cromatografia em Contracorrente de Alta Velocidade), uma técnica de separação em contracorrente do tipo hidrodinâmica, ainda seja a mais utilizada (SKALICKA-WOŹNIAK; GARRARD, 2015). Além de todas as vantagens que as técnicas em contracorrente apresentam – como i. a ausência de um suporte sólido, o que diminui consideravelmente ou elimina a possibilidade de degradação das substâncias, bem como diminui o gasto na aquisição de colunas; ii. não há necessidade de pré-tratamento de amostra; iii. maior capacidade de trabalhar com grandes volumes e com amostras mais concentradas e em maiores quantidades; iv. uso de solventes grau analítico que são menos onerosos; v. não há perda de resolução cromatográfica no scaling up; entre outros –, a CPC ainda apresenta vantagens em relação a HSCCC como maior controle da fase estacionária e menor perda de resolução no scaling up (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ; HODUREK, 2017).
Por fim, a CPC, assim como todas as separações em contracorrente, é considerada como um técnica de “green chromatography” (ou cromatografia verde, ou ainda química verde –
green chemistry), por ter um baixo consumo de solvente (BOJCZUK; ŻYŻELEWICZ;
HODUREK, 2017). Devido ao aumento da preocupação e da regulamentação ambiental em diversos países, a preocupação com o impacto ambiental é uma tendência e vem influenciando desde o desenvolvimento de métodos até o de tecnologias e técnicas analíticas (FUNARI et al., 2013). Dessa forma, o isolamento por CPC diretamente do extrato bruto é um método importante em química verde, uma vez que não temos a produção de resíduo sólido do adsorvente usado em cromatografia sólido-líquido, e a quantidade de solventes orgânicos utilizados é reduzida, uma vez que o método é realizado diretamente do extrato hidroetanólico (FRIESEN et al., 2015).
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2.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE CONTROLE DE QUALIDADE E PADRONIZAÇÃO DE