Les cellules humaines déficientes en XPC et Pol présentent

humaines XP- C irradiées à une faible dose d’UVC

2. Étude de lignées cellulaires déficientes en XPC et/ou en Pol en réponse aux

2.2.1 Les cellules humaines déficientes en XPC et Pol présentent

les deux phénotypes XP-C et XP-V et sont très sensibles à l'irradiation aux UVC

J’ai ensuite étudié les fibroblastes humains double-déficients XP-C/Pol KD

(Figure 33). Il est important de préciser que toutes les expériences avec ces cellules ont été faites en parallèle avec les cellules isogéniques XP-C et XP-C⁺ portant un shRNA contrôle (shCTL), même lorsque « shCTL » n’est pas précisé dans les figures.

Figure 33. Les cellules XP-C/Pol KD

sont déficientes en XPC et en Pol . δ’expression endogène des protéines XPC et Pol a été détectée par western blot dans les cellules V, XP-C, XP-C⁺ et XP-C/Pol KD

Tout d’abord, j’ai observé, pendant la culture, que le clone XP-C/Pol KD

avait une vitesse de prolifération plus lente que celle des cellules parentales XP-C. Afin de vérifier cela, la prolifération de ces cellules a été analysée en temps réel grâce à un

système qui permet de suivre l’impédance électrique à travers des microélectrodes intégrées en dessous de chaque puits (xCelligence system, Roche). À partir de l’impédance, l’index cellulaire est déterminé par un logiciel. Cette donnée correspond à l’espace du puits occupé par les cellules. δ’index cellulaire est donc directement proportionnel au nombre de cellules dans un puits. J’ai ainsi évalué l’index cellulaire des cellules XP-C/Pol KD

et des cellules XP-C en absence de traitement toutes les heures environ, jusqu’à 9θ heures (Figure γζ). Et, j’ai ainsi confirmé que les XP-C/Pol KD

prolifèrent plus lentement que les cellules isogéniques XP-C. Ceci est en accord avec des résultats publiés précédemment avec des cellules U2OS (lignée de cellules humaines d’ostéosarcome) dont l'expression de Pol a été réduite par le même pEBV-shRNA (Rey et al. 2009).

12 24 36 48 60 72 84 96 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 XP-C XP-C/PolKD Temps (h) In d e x c e ll u la ir e

Figure 34. Prolifération des cellules XP-C et XP-C/Pol KD

en absence de traitement. δ’index cellulaire de ces deux lignées cellulaires a été suivi en temps réel par xCelligence system.

Par ailleurs, la caractéristique du phénotype XP-V (déficience en Pol dans un fond NER+) est l’hypersensibilisation des cellules XP-V aux UV après addition de caféine (Lehmann et al. 1975; Cleaver 1989). Afin d’évaluer si le niveau d’expression de Pol était suffisamment faible, j’ai donc étudié la prolifération des cellules XP-C/Pol KD

exposées à différentes doses d’UVC en présence de 1 mM de caféine. Comme nous l’avons vu, les cellules XP-C sont très sensibles aux UVC et leur prolifération est fortement affectée déjà après exposition à 5 J/m² (Figure 19). Afin de pouvoir observer un éventuel effet de la caféine sur les cellules isogéniques XP-C/Pol KD, j’ai décidé de

tester l’effet combiné des rayons UVC et de la caféine uniquement à des faibles doses d’UVC (1, β et γ J/m²). Dans un premier temps, j’ai vérifié d’une part, que les conditions choisies permettaient d’observer la sensibilisation des cellules XP-V aux UVC par la caféine et d’autre part, que la prolifération des cellules XP-C+ n’était pas atteinte par ce double traitement (Figure 35). En effet, la prolifération des cellules XP-C⁺irradiées n’a pas été affectée par la présence de caféine et est restée constante autour de 95% du contrôle non irradié quelque soit la dose d’UVC, en présence et en absence de caféine. Cependant, la prolifération des cellules XP-V a été réduite de presque moitié lorsque la caféine a été ajoutée aux cellules exposées à 1 J/m² (82% du contrôle non irradié en absence de caféine et ζθ% en présence de caféine). Suite à l’exposition à β J/m², cet effet a été encore plus prononcé avec 74% de cellules par rapport au contrôle en absence de caféine contre 19% du contrôle en présence de caféine. Donc, les cellules naturellement déficientes en Pol ont été fortement sensibilisées par la présence de caféine dès l’exposition à 1 J/m². 0 1 2 3 1 10 100 XP-V XP-V + CAF XP-C⁺ XP-C⁺+ CAF *** *** *** UVC (J/m²) P ro li fe ra ti o n c e ll u la ir e (% )

Figure 35. Prolifération cellulaire 72 heures après différentes doses d’UVC en présence ou en absence de 1 mM de caféine (CAF). La prolifération des cellules XP-C⁺ et XP-V a été évaluée par le test XTT et est représentée en pourcentage par rapport au contrôle non irradié correspondant. Chaque point représente la moyenne (± s.e.m.) de 3 expériences indépendantes. La significativité des différences entre l’irradiation aux UVC en présence et en absence de caféine dans les cellules XP-V est indiquée (***P < 0,001).

D’après la Figure γθ, la présence de la caféine a également diminué la prolifération des cellules XP-C/Pol KD

dès la dose de 1 J/m² par rapport à celle des cellules exposées uniquement aux UVC. En effet, les cellules XP-C/Pol KD

à ιη% du contrôle non irradié en réponse uniquement à l’exposition à 1 J/m² contre βη% en présence en plus de caféine. δ’effet de la caféine sur ces cellules double-déficientes a été encore plus prononcé après 2 J/m² où la caféine a provoqué une réduction de 90% dans la prolifération cellulaire par rapport à celle en absence de caféine. Par contre, la prolifération des cellules XP-C n’a pas été affectée par la présence de caféine après 1 J/m² (94% et 86% du contrôle respectivement en absence et présence de caféine après 1 J/m²). Néanmoins, à partir de 2 J/m², la prolifération de ces cellules a été modifiée par ce double traitement. À cette dose, la prolifération des cellules XP-C a été réduite de 50% lorsque la caféine a été ajoutée au milieu de culture (Figure 36). Ces résultats montrent que le niveau d’expression de Pol dans les cellules XP-C/Pol KD

est suffisamment faible pour que la caféine aggrave leur sensibilité aux UV, comme elle le fait pour les cellules XP-V. Par conséquent, ces résultats confirment fonctionnellement l’extinction de Pol dans les fibroblastes humains XP-C.

0 1 2 3 1 10 100 XP-C/PolKD XP-C/PolKD + CAF XP-C XP-C + CAF *** *** ** *** *** UVC (J/m²) P ro li fe ra ti o n c e ll u la ir e (% )

Figure 36. Prolifération cellulaire 72 heures après différentes doses d’UVC en présence ou en absence de 1 mM de caféine (CAF). La prolifération des cellules XP-C et XP-C/Pol KD

a été évaluée par test XTT et est représentée en pourcentage par rapport au contrôle non irradié correspondant. Chaque point représente la moyenne (± s.e.m.) de 3 expériences indépendantes. δa significativité des différences entre l’irradiation aux UVC en présence et en absence de caféine dans les cellules XP-C et XP-C/Pol KD

est indiquée (**P < 0,01; ***P < 0,001).

Ensuite, j’ai caractérisé les conséquences de l’extinction de Pol dans les réponses cellulaires et moléculaires des cellules XP-C. Tout d’abord, j’ai pu constater lors de l’étude de prolifération des cellules irradiées en présence et en absence de caféine (Figure 36), que les cellules XP-C/Pol KD

présentaient une prolifération diminuée par rapport à celle des cellules XP-C en réponse uniquement aux UV. Afin de confirmer cette observation, les fibroblastes isogéniques XP-C et XP-C/Pol KD

irradiés à β, η et 10 J/m² d’UVC et comptés 72 heures plus tard (Figure 37). Les résultats montrent clairement que la prolifération des cellules XP-C/Pol KD

a été beaucoup plus perturbée par l'irradiation aux UVC que celle des cellules XP-C. En effet, 72 heures après 2 et 5 J/m² les cellules XP-C étaient respectivement à 69% et à 48% de leur contrôle non irradié alors que les cellules XP-C/Pol KD

étaient respectivement à 45% et à 18% de leur contrôle non irradié. Après 10 J/m², les cellules XP-C étaient à près de 20% de leur contrôle alors que la quasi-totalité des cellules XP-C/Pol KD

étaient mortes (Figure 37). 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 120 XP-C⁺ XP-C XP-C/ PolKD

***

UVC (J/m²) P ro li fe ra ti o n c e ll u la ir e (% )

Figure 37. Prolifération des fibroblastes XP-C⁺, XP-C et XP-C/Pol KD

72 heures après 2, 5 et 10 J/m² d’UVC. Chaque point représente la moyenne et les barres d’erreur correspondent à l’erreur standard d’au moins trois expériences réalisées de façon indépendante. La significativité des différences entre les cellules XP-C et XP-C⁺ ainsi que celle entre les cellules C et XP-C/Pol KD

sont indiquées (***P < 0,001).

A partir de ce résultat obtenu pour le clone dont l’extinction de Pol était maximale par rapport aux autres clones isolés, je me suis demandée si l’inactivation du gène POLH obtenue dans ces autres clones (Figure 32) ne serait tout de même pas suffisante pour avoir un effet sur la diminution de l’expression de Pol . Et, d’après la Figure 38, le clone choisi (XP-C pBD1045 clone 1, XP-C/Pol KD

) a effectivement été le seul à présenter une diminution de la prolifération après exposition aux UVC par rapport aux cellules isogéniques XP-C. Ce résultat confirme que l’extinction de Pol doit être maximale pour que la cellule présente un phénotype associé.

92 0 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 XP-C shCTL XP-C pBD045 clone1 XP-C pBD1047 clone150-1 XP-C pBD1047 clone300-5 XP-C pBD1047 clone300-7 UVC (J/m²) P ro lif e ra ti o n c e llu la ir e ( % )

Figure 38. Prolifération des différents clones isolés 72 heures après 2, 5 et 8 J/m² d’UVC. Chaque point représente le pourcentage de prolifération des cellules irradiées par rapport à celle du contrôle non irradié.

La prolifération des cellules XP-C/Pol KD

était donc plus fortement altérée 72 heures après exposition aux UVC que celle des fibroblastes XP-C. Néanmoins, ces cellules semblaient survivre aux plus faibles doses d’UVC testées, β et η J/m². Je me suis demandée quel serait l’effet de ces doses sur une période post UVC plus longue. J’ai donc étudié la prolifération cellulaire six jours après l’irradiation à ces β doses d’UV (Figure γ9). Et, j’ai pu constater que les cellules XP-C/Pol KDn’ont survécu qu’à 2 J/m².

Figure 39. Prolifération des cellules XP-C/Pol KD

6 jours après 2 et 5 J/m². Les cellules XP-C/Pol KD ont été fixées et colorées au crystal violet θ jours après l’exposition aux UVC.

J’ai quantifié la prolifération des fibroblastes XP-C+

, XP-V (déficients en Pol ), XP-C et XP-C/Pol KD

θ jours après l’exposition à β J/m² (Figure 40). Comme attendu, un défaut en Pol sur un fond NER+ (cellules XP-V) sensibilise les cellules aux UVC (60% du contrôle non irradié) mais pas autant que les cellules XP-C déficientes en GGR (ββ% du contrôle). De plus, j’ai observé de nouveau que l’extinction de Pol dans les cellules XP-C a conduit à une sensibilité très importante de ces cellules même à une faible dose d’UVC avec une prolifération à θ% du contrôle non irradié (Figure ζ0). Par conséquent, la sensibilisation des cellules XP-C par l’extinction de Pol observée à γ jours après exposition à 2J/m² (prolifération des cellules XP-C/Pol KD

à 65% de celle des fibroblastes XP-C) a été encore plus prononcée 6 jours après (prolifération des cellules XP-C/Pol KD

était à 27% de celle des fibroblastes XP-C).

XP-C ⁺ XP-V XP-C XP-C/PolKD 0 20 40 60 80 100

P

ro

li

fe

ra

ti

o

n

c

e

ll

u

la

ir

e

(

%

)

Figure 40. Prolifération des fibroblastes XP-C⁺, XP-V, XP-C et XP-C/Pol KD

6 jours après l’exposition à 2 J/m² d’UVC. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle non irradié.

Afin de mieux comprendre les effets de l’exposition aux UVC sur la prolifération des cellules XP-C/Pol KD

, j’ai analysé le cycle cellulaire et l’induction de la fragmentation de l’ADN de ces cellules irradiées avec β J/m² par cytométrie de flux.

Tout d’abord, j’ai observé qu’en absence de traitement, les cellules XP-C/Pol KD

présentaient un cycle cellulaire comparable à celui des cellules isogéniques XP-C, malgré un taux de prolifération réduit (Figures 41-43 et 21). Jusqu’à ι heures après β J/m², les fibroblastes XP-V et XP-C/Pol KD

avaient une distribution dans les phases du cycle cellulaire (Figures 41 et 43) comparable à celle observée pour les cellules NER+ et XP-C (Figures 21 et 22).

94 Figure 41. Cycles cellulaires des fibroblastes XP-V et XP-C/Pol ^KD aux temps courts après l’exposition à 2 J/m². δes graphiques représentent l’incorporation de BrdU en fonction du contenu en ADN. Les trois phases du cycle sont indiquées dans le premier graphique en haut à gauche Cette expérience a été faite 2 fois individuellement et des graphiques représentatifs sont montrés. En haut à droite de chaque graphique, la distribution correspondante des cellules dans les phases du cycle observée uniquement par le marquage du contenu en ADN par PI est indiquée.

Néanmoins, 24 heures après 2 J/m², les fibroblastes XP-V se sont accumulés en phase S avec 11% de cellules en réplication en plus qu’en absence de traitement (θθ% versus 55%) (Figures 42 et 43). En outre, 72 heures après l'exposition aux UVC, les cellules XP-V ont présenté une légère accumulation de cellules en phase G2 (21% de cellules en G2 après irradiation versus 17% de cellules non traitées). De façon comparable, 24 heures après irradiation, les fibroblastes XP-C/Pol KD

se sont accumulés en phase S (58% de cellules en réplication après UVC et 45% en absence de traitement). Cependant, ces cellules se sont également accumulées en phase G2, comme les cellules isogéniques C (Figure 22, 42 et 43). A 72 heures post UVC, les fibroblastes XP-C/Pol KD

étaient toujours arrêtés en phase G2 (24% et 36% de cellules en G2, respectivement 24 et 72 heures après UVC, par rapport à 14% sans aucun traitement). De plus, l’incorporation du BrdU était totalement hétérogène, ce qui indique que la réplication de l'ADN était complètement perturbée 72 heures après 2 J/m² (Figure 42). Enfin, 24 heures après une dose plus élevée d’UVC (5 J/m²), les cellules XP-V se sont clairement accumulées en début de phase S, tandis que les cellules XP-C/Pol KD

ont présenté une accumulation accrue de cellules à la fois en phases S et G2 conjointement à une diminution drastique de l'incorporation de BrdU (Figure 42).

95 Figure 42. Cycles cellulaires des fibroblastes XP-V et XP-C/Pol ^KDaux temps longs après l’exposition à 2 J/m². Cette expérience a été faite 3 fois individuellement et des graphiques représentatifs sont montrés. En haut à droite de chaque graphique, la distribution correspondante des cellules dans les phases du cycle observée uniquement par le marquage du contenu en ADN par PI est indiquée.

En outre, 22% de cellules XP-C/Pol KD

ont été retrouvées en Sub-G1 72 heures après 2 J/m², alors qu'aucune fragmentation significative de l'ADN n'a été détectée dans les cellules XP-V irradiés (Figure 43).

Figure 43. Distribution dans les phases du cycle cellulaire des cellules V et XP-C/Pol ^KDà différents temps après 2 J/m². Les histogrammes représentent la moyenne des pourcentages de cellules dans chaque phase du cycle obtenus à partir du co-marquage de BrdU et du contenu en ADN réalisé au moins 2 fois de façon indépendante Le contrôle non irradié (NI) correspondant au temps 24 heures est indiqué. La fraction de cellules en Sub-G1 est indiquée 72 heures après 2 J/m².

En résumé, j’ai réussi à valider l’extinction de Pol dans les cellules XP-C/Pol KD d’un point de vue fonctionnel. En effet, j’ai montré que l’extinction de Pol a provoqué, d’une part, une diminution de la prolifération des cellules XP-C en absence de traitement, et d’autre part, une sensibilisation de ces cellules à une exposition aux UVC par la caféine, caractéristique des cellules XP-V. Ensuite j’ai étudié les réponses aux dommages provoqués par les UVC de ces cellules déficientes en NER et en Pol . Tout d’abord, j’ai observé que la prolifération de ces cellules a été plus affectée par des faibles doses d’UVC que celle des cellules isogéniques XP-C. Par ailleurs, 24 heures après irradiation, les cellules XP-C/Pol KD

se sont accumulées à la fois en phases S et Gβ de leur cycle cellulaire, montrant ainsi qu’elles ont à la fois le phénotype d’une cellule XP-V et d’une cellule XP-C. Par contre, à la différence des lignées déficientes en NER ou en Pol , ιβ heures après UV, leur cycle cellulaire était complètement altéré. En effet, la progression des fourches de réplication était perturbée d’une part, et d’autre part l’arrêt en Gβ était encore plus prononcé qu’à βζ heures après l’irradiation. Enfin, à ce temps, l’exposition à β J/m² n’a induit une fraction significative de cellules en Sub-G1 que dans les cellules XP-C/Pol KD

2.2.2 L’exposition à une faible dose d’UVC induit des niveaux élevés de

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