Causes de rejet de séquences d’images

Des 809 séquences d’images traitées par l’algorithme, seulement 71 ont été rejetées de l’analyse, dont 36 en raison d’une segmentation jugée inefficace lors de la vérification par l’utilisateur. Le taux de succès de segmentation a donc atteint 95,6%. Les principales raisons de rejet et leur occurrence pour chacun des types de xénogreffe sont résumées dans le Tableau 4.2.

Tableau 4.2: Raisons de rejet de séquences d’images segmentées par l’algorithme en fonction du type de xénogreffe imagé

Catégorie de rejet Occurrence (%)

Globale 22Rv1 PC3 OV90 TOV112D

Segmentation du signal

de fond vert 4,20 0 0,58 9,12 3,63

Segmentation du signal

de fond rouge 0,25 0,63 0 0 0,52

Signal faible dans les

deux canaux 3,58 0 1,75 8,07 1,55

Présence d’une particule

fluorescente indésirable 0,74 0,01 0 1,05 1,04

Toutes catégories 8,77 0,64 2,33 18,24 6,74

La principale raison de rejet a été la sur-segmentation du signal vert à cause d’un bruit de fond élevé. Toutefois, ceci ne s’est surtout produit que pour les xénogreffes de type OV90 et TOV112D, toutes deux formées de cellules de cancer de l’ovaire. Il semblerait que dans certaines situations, les membranes cellulaires des cellules cancéreuses deviennent perméables aux molécules fluorescentes produites suite au clivage des groupements acétate du CTG. Ceci provoquerait une dissipation des molécules fluorescentes dans le milieu environnant de la TMD, entraînant une diminution du contraste entre les cellules viables marquées et l’environnement. Dans ces circonstances, l’algorithme arrive plus difficilement à distinguer le signal des cellules de celui qui a été relâché dans le milieu, ce qui peut donner une lecture de viabilité faussée. Un exemple de sur-segmentation du signal vert est montré dans la Figure 4.8. Malgré la défaillance de l’algorithme développé, celui-ci performe tout de même mieux que la méthode d’Otsu appliquée seule.

Figure 4.8: Exemple d’image avec bruit de fond vert élevé et segmentations erronées résultantes. A) Projection maximale de toutes les tranches optiques, barre d’échelle = 100 µm. B) Tranche optique à 20 µm de profondeur dans le tissu, canal vert. C) Segmentation résultante pour l’image montrée en B en utilisant l’algorithme développé. D) Segmentation résultante pour l’image montrée en B en utilisant la méthode d’Otsu non modifiée. Bordures ajoutées pour fins de clarté.

La sur-segmentation du signal rouge s’est aussi produite dans quelques cas. Toutefois, cette sur-segmentation n’a pas été causée par un signal de fond trop élevé. Effectivement, les précautions qui avaient été prises pour minimiser le signal de fond rouge, soit l’utilisation de milieu sans phénol rouge ainsi que le double rinçage des systèmes suite au marquage des échantillons avec les solutions de CTG et de PI, se sont avérées très efficaces. La sur-segmentation, dans ce cas, était plutôt due à une quasi-absence de signal dans le canal rouge à travers toute la séquence d’images. La méthode d’Otsu cherche tout de même à trouver le seuil qui sépare les pixels en deux groupes en fonction de leur intensité. Dans certains rares cas comme celui montré à la Figure 4.9, l’algorithme segmente un très faible signal résiduel se trouvant dans les puits microfluidiques ainsi qu’un bruit non perceptible dans les images. Pour éviter cette situation, une condition d’intensité minimale du 99,99e _{percentile de l’image pourrait être ajoutée, par exemple, afin de vérifier qu’un}

véritable signal soit présent dans l’image avant de procéder à la segmentation. Ainsi, on accepterait de perdre le signal seulement si celui-ci représente moins de 0,01% de tous les pixels de la

séquence, ce qui correspond à moins de 400 pixels par séquence de 15 tranches optiques (de 512 par 512 pixels). La valeur précise du percentile ainsi que la valeur de l’intensité minimale pourraient être déterminées à l’aide de la banque d’images disponible, afin de s’assurer que l’algorithme suive son cours dès qu’un faible signal provenant des cellules marquées est présent dans la séquence.

Figure 4.9: Exemple d’image où l’absence de signal rouge provoque une segmentation erronée. A) Projection maximale de toutes les tranches optiques, barre d’échelle = 100 µm. B) Tranche optique à 20 µm de profondeur dans le tissu, canal rouge. C) Segmentation résultante pour l’image montrée en B en utilisant l’algorithme développé. D) Segmentation résultante pour l’image montrée en B en utilisant la méthode d’Otsu non modifiée.

Les deux autres catégories de rejet recensées et illustrées à la Figure 4.10 étaient dues à des problèmes expérimentaux, et non à des problèmes de segmentation par l’algorithme. Premièrement, certaines TMD paraissaient très faiblement marquées par les deux fluorophores. Bien que l’algorithme se soit comporté correctement pour ces images, le résultat n’a pas été conservé vu la faible proportion de cellules marquées. Le marquage de faible intensité se produit souvent lorsque les puits sont complètement remplis de cellules ou lorsque les TMD ont adhéré au fond du piège. Dans les deux cas, les cellules au fond du puits ont moins directement accès aux fluorophores qui doivent diffuser à travers le tissu pour atteindre certaines portions de celui-ci qui

se trouvent dans la zone imageable par microscopie confocale inversée. Néanmoins, cela n’a posé problème que dans environ 4% des séquences d’images. Deuxièmement, des particules fluorescentes ont été repérées dans les images à quelques reprises. Lorsqu’elles composaient plus d’environ 10% du signal, les images correspondantes ont été rejetées. Ces particules peuvent être des fragments de plastique provenant des embouts de pipette ou des poussières s’étant déposées dans l’entrée des systèmes lors de leur manipulation en dehors de la hotte biologique.

Figure 4.10: Autres exemples d’images rejetées de l’analyse.A) Projection maximale d’une TMD ayant une faible proportion de cellules marquées. B) Projection maximale d’une TMD piégée avec une particule fluorescente indésirable. Barres d’échelle = 100 µm.

Pour les deux xénogreffes du cancer de l’ovaire, OV90 et TOV112D, des taux de rejet plus élevés ont été répertoriés. Un bruit de fond vert élevé a été observé dans les séquences d’images, ce qui a affecté la performance de l’algorithme dans 6,9% des cas. En plus, pour la xénogreffe OV90, le marquage semblait très faible pour une proportion importante (8%) d’échantillons. Néanmoins, l’algorithme de viabilité a permis d’estimer la viabilité de manière plus quantitative et en tenant compte de l’ensemble de la séquence d’images acquise en microscopie confocale.