WNT/Β‐CATENIN

2.4.3. WNT/Β‐CATENIN  

Besides LIF and BMP4 signaling, the canonical Wnt/β‐catenin pathway is also involved in  maintaining the pluripotent state of both mouse and human ESC [48]. As can be seen in  Figures 2 and 3, upon binding of the Wnt protein on the surface receptor Frizzled (Fzd), the  glycogen‐synthase kinase‐3 (GSK3) gets inhibited, leading to a reduced degradation and,  thus, increased levels of  β‐catenin [43]. After translocation to the nucleus,  β‐catenin acts  together with members of the Tcf transcription factors to form complexes that mediate  gene expression. As shown in Figure 3, Tcf3 represses the pluripotency genes Oct4, Nanog  and Sox2.  β‐catenin blocks the suppressive function of Tcf3 [49, 50]. Subsequently, the  target genes Oct4, Nanog and Sox2 are activated [48]. Berge et al. demonstrated the 

dependency of mESC for Wnt signals, in contrast to EpiSCs [51].  β‐catenin does not only  operate with Tcf3, but promotes pluripotency together with Tcf1 [50]. 

Figure 3. Wnt/βcatenin, E‐cadherin and LIF pathways in mESC are involved in the maintenance of  pluripotency in mESC. The correlation between the Wnt pathway and the Tcf3 and Tcf1 proteins are  illustrated. After mobilization of βcatenin into the nucleus, it complexes with Tcf3. By these means  Tcf3’s  suppressive  function  on  pluripotency  genes  like  Oct4  is  abolished  and  pluripotency  is  maintained. In a complex with Tcf1, βcatenin activates pluripotency associated genes. (Taken from  [49]). 

2.5. Transcription factors involved in pluripotency 

Three  transcription factors have been  shown to play a major role in  maintaining  the  pluripotent state of both the inner cell mass and embryonic stem cells: Nanog, Oct3/4 and  Sox2.  

2.5.1. NANOG is a transcription factor that is found in both human and mouse pluripotent  stem cells [52]. While Nanog is necessary for the formation of germ cells [52], it does not 

reported a trend towards differentiation of cells upon transient downregulation of Nanog,  but not commitment to differentiation. Furthermore, Nanog seems indispensable for the 

formation  of  germ  cells  since  Nanog^‐/‐  cells  cannot  reach  the  genital  ridge  during  development [53]. Nanog can preserve pluripotency in mESC cells in the absence of LIF, and  by these means LIF/Stat3 signaling is circumvented [52]. The sequence that Nanog binds to  has been proposed but it is still a controversial matter [33]. 

Loh  et  al. point out the importance of Nanog as a key regulator of pluripotency  by  controlling Oct4 and Sox2 expression levels. Indeed, physiological levels of Oct4 and Sox2  prevent differentiation, while overexpression of Oct4 triggers differentiation [54]. Both  Nanog and Oct4 have Esrrb and Rif1 as common targets. These have been shown to be  important for conserving pluripotency in mESC [55].  

2.5.2.  OCT4 is member of the octamer transcription factor class. As the class name  indicates, Oct4 binds to a DNA site composted of the eight base pairs ATGCAAAT [56, 57]. 

Oct4 is member of the POU (Pit, Oct and Unc) transcription factor class that interacts with  DNA through two DNA binding domains [33], one low and one high affinity binding domain  [58]. 

To uncover the role of Oct3/4 in ESC, Niwa et al. regulated the expression levels of Oct3/4  via a tetracycline‐regulated transactivator and a transactivator‐responsive Oct3/4 transgene  in Oct3/4 null mESC [54]. They show that ESC do not keep their pluripotent state but  differentiate  into  trophoectoderm  upon  downregulation  of  Oct3/4,  regardless  of  the  presence or absence of LIF. Since an overexpression of Oct3/4 triggers differentiation as  well, Niwa et al. concluded that a controlled Oct3/4 level within ES cells is necessary to keep 

the  stem  cell  phenotype.  They  defined  the  differentiation  threshold  at  50%  of  the  endogenous Oct3/4 expression levels.  

Loh et al. determined the targets of Oct4 and Nanog in the whole mESC genome using,  among  other  methods,  paired‐end  ditag  technology  in  combination  with  chromatin  immunoprecipitation (ChIP) [55]. Between the human and the mouse genome, Oct4 and  Nanog targets did not result to overlap much, as this accounted for 9% for Oct4 and 13% for  Nanog, with ~1000 binding sites for Oct4 and ~3000 for Nanog. Nevertheless, Loh et al. 

demonstrated that Oct4 and Nanog shared some important targets. Downstream genes of  Nanog and Oct binding targets were shown to be involved in maintaining pluripotency.  

Nanog is not the only transcription factor binding at the same genomic location as Oct4. In  fact, Oct4 was proposed as “anchor point” for the further binding of other transcription  factors  [38].  Furthermore,  Oct4  and  other  factors  seem  to  autoregulate  their  own  expression levels [38]. Enhancer regions  of  Oct4 and Nanog are  bound by  additional  transcriptions factors. 

2.5.3 SOX2 belongs to a family of proteins that contains a “high mobility group (HMG) box  DNA binding domain box”. Sox2 was shown to bind in minor grooves of DNA at defined  binding sites [33]. Loh et al. demonstrated that Sox2 binding sites overlap to a great extends  with Oct4 sites, indicating that Sox2 and Oct4 act together to mediate their target genes. 

2.6. The chromatin state in ESC 

Transcription factors are not the only key actors for conserving the pluripotent state of ESC:  

non‐coding‐  and  microRNA  as well  as  the  chromatin  status  of ESC [38] also  play  an  important role. 

In  ESC  chromatin  is  organized  to  a  higher  degree  as  euchromatin  in  comparison  to  differentiated cells. While cells commit to different lineages during differentiation, they  reorganize their chromatin structure and more compact heterochromatin is found [59, 60]. 

Chromatin  structure  is  influenced  by  the  methylation  status  of  DNA,  as  well  as  the  modifications of histones. In addition, ATP‐dependent enzymes remodeling chromatin have  been shown to influence the chromatin status in ESC [60]. 

2.7. The metabolism in ESC 

Knowledge has been gained on the genetic and epigenetic status of pluripotent stem cells. 

Chromatin status as well as DNA methylation pattern change extensively during the transit  from pluripotent to differentiated cells.  

Besides  the  genetic  and  epigenetic  status  being  important  to  keep  the  pluripotent  characteristics  within  a  ESC,  the  group  of  Banerjee  pointed  out  the  importance  of  metabolism in the control of ESC proliferation and differentiation [61]. They used the  chemical  component  Carbonyl  Cyanide  m‐Chlorophenylhydrazone  to  knock  down  mitochondrial function. While the cell cycle phase was not affected, the proliferation rate of  mESC was slowed down in comparison to untreated mESC, indicating the importance of  mitochondria  on  ESC  proliferation,  also  during  differentiation.  Indeed,  the  expression 

profiling after seven days of treatment revealed significant differences in genes related to  development and differentiation. Further investigation needs to be done to understand the  role of mitochondria within proliferating and differentiating ESC. However, these results  underline  the  importance  of  grasping  the  impact  of  mESC  metabolism  regulation  in  pluripotency and differentiation conditions.