permettant l’assignation en classe II du résultat suivant : DR4, DR14; DQ7.
Dans le cas des dossiers de greffes (organes ou CSH), le typage doit être confirmé par une deuxième technique sur un nouveau prélèvement. Ainsi le deuxième typage, réalisé par PCR-SSO Luminex® sur un deuxième prélèvement, révèle alors les résultats les plus probables suivants : DRB1*04 :01, DRB1*14 :01; DQB1*03 :01, DQB1*05 :03. Pour une meilleure compréhension du dossier, il faut connaître les équivalences de nomenclature entre la biologie moléculaire et la sérologie, à savoir DRB1*04 :01 équivaut à DR4, DRB1*14 :01 équivaut à DR14, DQB1*03 :01 équivaut à DQ7 et DQB1* 05 :03 donne une image sérologique correspondant à DQ5. Un allèle DQB1*05 :03 (DQ5) est donc trouvé en SSO alors qu’aucune réaction DQ5 n’est détectée en sérologie.
Suite à cette discordance, la technique de sérologie a été répétée sur le deuxième prélèvement utilisé pour la PCR-SSO. Les résultats obtenus sont identiques aux premiers résultats de sérologie à savoir en classe II : DR4, DR14; DQ7.
Le typage a été dans un premier temps contrôlé en PCR-SSP générique (kit DQ Low, Olerup SSP®) (Figure 39), où l’on retrouve la preuve de la présence des deux groupes d’allèles DQB1*03 et DQB1*05.
Figure 39 : Photographie du gel d’agarose obtenu en PCR-SSP (Olerup®)
La flèche rouge désigne la bande spécifique témoignant de la présence d’un allèle du groupe DQB1*05, les flèche bleues désignent DQB1*03. La présence de DQB1*05 ne laisse ici pas de doute possible.
Le contrôle en séquençage Sanger monoallélique (SSBT) est réalisé sur un troisième prélèvement. Les exons 2 et 3 du gène DQB1 ont été séquencés dans les deux sens (reverse et forward). Le résultat confirme celui trouvé précédemment en biologie moléculaire: DQB1*03:01:01G, DQB1*05:03:01G.
Les discordances entre une méthode de sérologie et de biologie moléculaire s’expliquent principalement, après exclusion des erreurs techniques, par la présence d’un allèle nul ou d’expression faible, non mis en évidence en sérologie. Le caractère nul ou faible de l’allèle peut être dû à l’existence d’une mutation, délétion ou insertion entrainant un codon stop, un décalage du cadre de lecture, une modification de la fixation des facteurs de transcription ou encore des problèmes pendant la phase d’épissage. Elles peuvent conduire à la diminution d’expression de la synthèse d’une protéine, à la synthèse d’une protéine aberrante, ou bien à l’absence de protéine, qui ne sera donc pas retrouvée en surface cellulaire par la sérologie. La localisation variable de la mutation explique que les techniques de biologie moléculaire peuvent parfois aboutir à un résultat non aberrant, dans le cas où la mutation est située en dehors des exons 2 et 3 principalement étudiés.
Dans ce cas, un séquençage du gène entier (du 5’UTR au 3’UTR) à partir d’une long range PCR en approche shot gun permettrait d’identifier la mutation responsable. Il pourrait s’agir d’un nouvel allèle.
Cette long range PCR n’est pas envisageable avec le seul kit disponible sur le marché (GenDx®), en effet, l’amplification du gène DQB1 se fait uniquement à partir de l’exon 2 jusqu’à l’exon 4. En revanche, pour Octobre 2015, il est prévu la mise sur le marché d’amorces qui permettront d’amplifier le gène DQB1 en entier, à partir du 5’UTR. A ce moment, nous pourrons envisager le séquençage de cet allèle. Ce cas n’est donc actuellement pas résolu.
Ce type de problème est rencontré assez fréquemment en histocompatibilité. Nous pouvons citer l’exemple de l’allèle HLA-A*02 :01 :01 :02L qui est caractérisé par une mutation singulière (T →C) présente dans le promoteur du gène HLA-A (enhancer B), responsable d’une diminution de son expression. La fixation des facteurs de transcription peut en effet être perturbée par l’existence d’une unique mutation. Le typage de cet allèle en sérologie montre une faible réactivité, tandis que le séquençage mono-allèlique des exons 2, 3 et 4 conduit à assigner l’allèle HLA-A*02 :01 :01 :01. Dans ce cas, seul le séquençage entier du gène permet de résoudre ce typage [117].
Au total, les dossiers sélectionnés ici montrent la fiabilité et l’intérêt du séquençage lorsque deux autres techniques amènent à des résultats discordants ou insuffisants (cas des allèles rares). La mise en place du séquençage a permis un gain de temps en évitant l’externalisation des demandes de typages qui étaient nécessaires dans ces cas.
Les derniers dossiers montrent également les limites de cette technologie et l’intérêt de mettre en place la NGS, avec une approche long range PCR. Elle permettrait de mettre en relation l’expression de la molécule avec les polymorphismes des régions 5’UTR et introniques.
DISCUSSION
Les dossiers étudiés précédemment, représentatifs de nombreux cas, mettent bien en évidence les faiblesses et les limites des techniques de typage HLA traditionnelles (PCR-SSO et PCR-SSP). Elles présentent de nombreux pièges pouvant amener à un résultat erroné, qui pourrait avoir des conséquences gravissimes pour le patient. Ces pièges sont évités par la mise en place de critères de validation stricts, mais aussi par la combinaison de plusieurs techniques différentes de typage. Le séquençage Sanger apporte une aide considérable pour limiter ces erreurs, même s’il n’est pas complètement épargné par ce type de problèmes.
En pratique, le séquençage de nouvelle génération peut être comparé à la technique de PCR-SSO, puisqu’il possède l’avantage de permettre la réalisation de plusieurs typages dans une seule série (plus d’une vingtaine d’échantillons typés sur les 6 loci en parallèle). Le séquençage de type Sanger remplacerait plutôt la PCR-SSP car seul le typage d’un patient sur les 5 loci peut être réalisé simultanément. Cependant, le temps de manipulation reste très long dans le cas de la NGS, 2 à 3 jours selon la technologie et avec plusieurs étapes d’interventions manuelles dans le cas du Ion torrent®, elle est surtout avantageuse dans le contexte des typages en grande série, comme ceux des DVMO. La résolution obtenue dépend de l’utilisation ou non du principe de long range PCR et peut être potentiellement très élevée avec ce dernier. En effet, différentes approches sont possibles, plus ou moins appropriées selon l’application considérée.
Nous allons aborder les différentes questions qui se posent à l’heure où la nouvelle génération de séquençage commence à se développer pour le typage HLA. Quelle approche semble la plus appropriée ? La NGS apporte-elle réellement un intérêt ? Et quelles sont les perspectives envisageables pour optimiser cette technologie, quelles en sont ses limites ?