CARACTERISATION DES CELLULES ISOLEES

L’étude des modifications induites par l’ingestion de spermine au niveau des protéines présentes dans les entérocytes nécessite l’obtention d’une population cellulaire aussi homogène que possible afin d’accroître la reproductibilité de l’analyse différentielle et d’optimiser la pertinence des modifications mises en évidence par l’analyse protéomique.

Les entérocytes, constituant la population cellulaire visée, sont récoltés selon une méthode voisine de celle décrite précédemment par Weiser (1973). Le jéjunum et l’iléon, après lavage, sont incubés dans une solution contenant de l’EDTA. La chélation du calcium provoque un affaiblissement des jonctions qui solidarisent les cellules. L’agitation permet ensuite de les détacher du chorion. Les cellules isolées sont caractérisées sur la base de trois paramètres : l’activité de la phosphatase alcaline, l’activité de disaccharidases et la présence du Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA).

1.1 Activité de la phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline est synthétisée de manière ubiquitaire dans l’organisme. Au sein de la muqueuse intestinale, sa présence est limitée aux entérocytes. Cette enzyme a donc été utilisée dans le but de caractériser les cellules isolées. La mise en présence de ces cellules avec un substrat chromogène de la phosphatase alcaline révèle que plus de 95% des cellules contiennent cette enzyme (figure III.1-1). De plus, la localisation majeure de la phosphatase

alcaline au niveau apical des cellules permet d’y distinguer la bordure en brosse caractérisant les entérocytes.

C A

D B

Figure III.1-1 : Observation en microscopie optique de cellules isolées de la muqueuse intestinale (A : objectif 20 x ; C : objectif 40 x). L’activité de la phosphatase alcaline est mise en évidence au moyen de Fast Red Tablets (B : objectif 20 x ; D : objectif 40 x).

1.2 Activité de disaccharidases

A B

Les cellules isolées contiennent de la lactase, de la maltase et de la sucrase (figure III.1-2).

Dans l’intestin grêle, ces enzymes sont spécifiques des entérocytes. Le traitement des animaux à la spermine modifie l’activité spécifique de ces enzymes de manière significative. D Dans le cas du jéjunum, on observe une diminution de l’activité spécifique de la lactase et une augmentation de celles de la maltase et de la sucrase (figure III.1-2). Ces modifications sont en accord avec des études précédentes (Dufour et al., 1988).

Dans l’iléon, l’activité spécifique de la lactase est significativement réduite. Par contre, celles

Jéjunum

Figure III.1-2 : Effets de l’administration orale de spermine à des rats non sevrés (0,40 µmol/g de poids corporel), une fois par jour pendant trois jours, aux jours 11, 12 et 13 (histogrammes noirs) sur l’activité spécifique (AS : µmol de substrat hydrolysé par minute et par g de protéines) de disaccharidases de cellules épithéliales intestinales isolées. Les rats ont été sacrifiés au jour 14. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± l’écart-type (n=6).*p<0,01, **p<0,001 par comparaison aux résultats obtenus à partir des rats témoins (histogrammes blancs).

L’absence d’effet de l’ingestion de spermine sur les activités spécifiques de ces enzymes est en désaccord avec ce qui a été précédemment observé par Dufour et al. (1988) dans le cas d’homogénats intestinaux. Etant donné que nos analyses ont été réalisées à partir de cellules isolées de l’épithélium intestinal, cette différence peut être expliquée par la localisation des disaccharidases le long de l’axe crypto-villositaire. En effet, tandis que la lactase est située au sommet des villosités, la maltase et la sucrase sont présentes dans la partie inférieure de celles-ci (Traber, 1990). Il est donc probable que l’isolement des cellules que nous avons réalisé n’a été que superficiel et que la récupération de toutes les cellules contenant la maltase et la sucrase nécessite un temps d’incubation plus long dans la solution d’EDTA, comme l’a montré Weiser (1973). On peut alors s’étonner de ne pas observer ce comportement dans le cas des cellules isolées du jéjunum. Cependant, de nombreux résultats montrent que le jéjunum et l’iléon se comportent comme deux organes distincts et, de plus, on ne peut exclure que l’étendue des cellules isolées portant les différentes enzymes, considérées au cours de notre étude, soit différente le long de l’axe crypto-villositaire dans le cas de ces deux parties d’intestin..

1.3 Présence du Proliferating Cell Nuclear Antigen

La protéine dénommée Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) est contenue, comme son nom l’indique, dans les cellules en prolifération. Dans l’épithélium intestinal, sa présence est limitée aux cellules souches des cryptes. L’immunodétection de cette protéine uniquement dans les cellules récoltées dans les derniers prélèvements de la solution contenant de l’EDTA, c’est-à-dire après 60 minutes d’incubation des organes dans cette solution (figure III.1-3), confirme que la durée d’incubation détermine le type cellulaire qui est récolté. La population cellulaire récoltée après 60 minutes correspond probablement aux cellules souches présentes au fond des cryptes.

Durée d’incubation dans l’EDTA (min) 10 30 40 60

Figure III.1-3 : Mise en évidence de la protéine PCNA au sein des populations cellulaires isolées successivement de l’épithélium intestinal à la suite de différentes durées d’incubation dans la solution d’isolement.

En conclusion, la méthode d’isolement des cellules de l’épithélium intestinal, que nous avons utilisée, fournit une population homogène d’entérocytes (>95%), identifiés sur base de la présence d’enzymes spécifiques telles que des disaccharidases et la phosphatase alcaline. Elle permet de disposer d’un matériel de départ optimal pour l’analyse des modifications survenant au niveau des protéines entérocytaires au cours de la maturation induite par l’ingestion de spermine. Elle permet également de cibler des populations cellulaires de l’axe crypto-villositaire en choisissant les durées d’incubation des fragments de muqueuse intestinale dans la solution permettant le détachement des cellules épithéliales. Dans la suite de ce travail, nous avons considéré l’analyse des modifications survenant au niveau des