Les résultats présentés à la section 3.2 Confirmation de la capacité des liaisons des constructions de Max à l’ADN et à l’ARN confirment ce qui était attendu pour Max*WT et Max*VL quant à la stabilité thermodynamique de ces protéines en absence d’acides nucléiques et en présence d’ADNdb puisqu’ils sont similaires à ce qui a déjà été rapporté pour ces protéines, c’est-à-dire des Tm aux environs de 45 °C et 66 °C pour Max*WT et d’environ 80 °C et 80 °C pour Max*VL en absence et présence d’ADNdb, respectivement (Jean-François et al., 2003). Pour ce qui est de Max°WT et Max°VL, qui n’ont jamais fait l’objet de publications, il était tout de même possible de supposer que chacun des homodimères allait être moins stable que leur équivalent ayant les résidus GSGC en C- terminal puisque la présence de ces résidus permet la formation d’un pont disulfure. Ainsi, pour ces deux protéines, le comportement attendu était similaire à celui observé chez Max*/CG et Max*VL/CG qui comportent les résidus GSGG en plus pour plusieurs raisons. Tout d’abord, le pont disulfure possible entre les cystéines chez Max*WT et Max*VL contribuant de façon importante à la stabilité du dimère ne peut être fait tant chez Max°WT ou Max°VL et Max*/CG ou Max*VL/CG et ces protéines diffèrent seulement par l’ajout de quatre acides aminés en C-terminal, les résidus importants pour les interactions en ai-d’i+3 et ei-g’i+5 ne sont pas affectés (Figure 19). Par contre, comme Max*/CG et Max*VL/CG comptent quatre acides aminés de plus que Max°WT et Max°VL, ils auraient la possibilité de former une hélice qui serait plus longue d’un tour et il était donc possible que leur dimère soit un peu plus stable. Ici encore, les résultats obtenus sont en accord avec ce qui était attendu. Les résultats obtenus pour Max°NTRY et Max°VL-NTRY ont quant à eux causé la surprise puisqu’il était attendu que la mutation de six des huit derniers en arginine déstabilise le dimère alors que les dimères ne semblent pas avoir été déstabilisés outre mesure par ces mutations qui auraient pu causer des répulsions électrostatiques. Tel que mentionné plus tôt, il est possible que les dimères ne soient pas vraiment stabilisés et que ce soit seulement la structure hélicale adoptée par la région poly-arginines qui soit stabilisée et que cela s’accompagne d’une ouverture de la glissière à leucine permettant d’éloigner l’extrémité C-
terminale des deux chaînes d’un dimère à cause de la répulsion électrostatique créée par les mutations X → R.
Pour ce qui est de la liaison à l’ARN, qu’il soit simple ou double brin, des différentes constructions, sans que les expériences n’aient déjà été effectuées pour Max*VL, il était
Représentation en roue hélicale des glissières à leucines, les résidus sont indiqués avec le code à une lettre de l’UICPA, les nombres en indice indiquent la position des résidus à partir de la méthionine initiale chez p22Max (ID UniProt P61244-1). Les flèches vertes indiquent les interactions favorables alors que les flèches rouges indiquent les répulsions. Tout comme pour la
Figure 4, les interactions et répulsions ne sont indiquées que sur un côté du dimère bien qu’en fait elles soient présentes des deux côtés. Ainsi, l’interaction hydrophobe entre la leucine 81 et la valine 78 aux positions d et a’ est aussi présente chez ces mêmes résidus en position a et d’. Figure adaptée de (Lavigne et al., 1998).
attendu que cette dernière soit en mesure de lier l’ARN puisque les résultats préliminaires générés par Martin Montagne ont démontré que cette protéine avait la capacité de faire pénétrer de l’ARN fluoromarqué à l’intérieur de cellules HeLa. Pour les autres protéines, il était attendu que les mutations dans la région C-terminale déstabilisent quelque peu le dimère et limitent la liaison à l’ARN, ce qui à la lumière des résultats obtenus ne semble pas être le cas puisque la différence entre le Tm des protéines comportant les mutations EQQVRALE→RRRRRRLR en présence d’acides nucléiques et le Tm des protéines sans ces mutations avec les mêmes acides nucléiques est faible. De plus, bien que plus courte que ce qui est rapporté, cette région comporte des similitudes avec un motif appelé arginine-rich motif qui est connu pour lier de l’ARN et adopter une structure hélicale (Ichimura et al., 1978; Lazinski et al., 1989; Tan et al., 1993). Considérant la formation d’espèce insoluble par Max°VL-NTRY et Max°NTRY en présence d’ARNsb au ratio utilisé pour ces expériences et à des ratios plus élevés en présence d’ARNdb, il est possible qu’il y ait liaison entre ces protéines et l’ARN par la région riche en arginine en plus de la région basique. Cette liaison pourrait mener à une sorte de réticulation dans laquelle deux dimères seraient liés à la même molécule d’ARN. Cette idée d’éviter cette réticulation sera abordée plus en détails à la section 4.3 Essais de knockdown de CCR2. Dans le but de déterminer s’il y a un phénomène de réticulation à certains ratios protéine : ARN et peut-être estimer la taille des espèces formées, des expériences de chromatographie d’exclusion stérique (SEC ou Size Exclusion Chromatography, aussi appelée filtration sur gel), diffusion dynamique de la lumière (DLSs ou Dynamic Light Scattering), microscopie à force atomique ou encore de microscopie électronique pourraient être réalisées. Ces deux dernières méthodes permettraient d’avoir non seulement une idée de la taille des espèces formées mais pourraient aussi permettre de déterminer l’allure générale de celles-ci, ce sont par contre des expériences
qui pourraient se révéler ardues à réaliser et elles requièrent du matériel plus spécialisé par rapport aux deux premières méthodes (Erickson, 2009; Hong et al., 2012; Hoo et al., 2008).
Afin de mieux comprendre le système et ce qui se produit avec la région riche en arginines, il pourrait être intéressant de refaire les expériences de caractérisation thermodynamique encore en conditions oxydantes sur une nouvelle construction qui serait identique en tous points à Max°NTRY ou Max°VL-NTRY à l’exception que les résidus GSGC en C-terminal ne seraient pas retirés (faisant ainsi Max*NTRY et Max*VL-NTRY). Les constructions ainsi obtenues se comporteraient possiblement d’une façon différente puisque le pont-disulfure à la toute fin des hélices induirait un rapprochement de celles-ci alors que la région riche en arginine induirait des répulsions électrostatiques. Il serait aussi alors possible que l’espèce la plus favorisée ne soit pas simplement un dimère mais un oligomère composé de dimères reliés entre eux par des ponts disulfures. La présence de ces résidus permettrait aussi le marquage avec différents fluorophores par un couplage avec maléimide. Il serait alors intéressant de marquer Max*NTRY ou Max*VL-NTRY avec une paire de fluorophore permettant le transfert d’énergie par résonance de type Förster (FRET) et par la suite de former des homodimères, une proportion desquels devrait être formée par une protéine couplée au donneur et l’autre protéine couplé à l’accepteur. En comparant avec un homodimère de Max*WT ou de Max*VL marqué de la même façon, le comportement de cette région riche en arginine pourrait être mieux compris. Toujours dans l’optique de mieux comprendre le système, il pourrait être pertinent de mettre ensemble Max°VL et Max°VL- NTRY pour qu’elles forment un hétérodimère et étudier la formation de celui-ci, par exemple à différents pH, comme ce fut fait pour Mad1 et Max, bien qu’ici, des pH supérieurs à 6,8 seraient probablement plus intéressants (Montagne et al., 2005). De la même façon, cette étude pourrait être intéressante avec Max°VL-NTRY en homodimère.