Caractérisation des protéines antigéniques

Les protéines antigéniques sont investiguées depuis de nombreuses années en utilisant des techniques de biologie moléculaire et des analyses sérologiques. Les principales études ayant permis la description de protéines antigéniques sont présentées dans le tableau 9.

Durant les années 60-70, les immunoglobulines aviaires (Edwards et al., 1970) (en particulier l’IgA (Goudswaard et al., 1978)), l’albumine sérique ainsi qu’une enzyme ayant des caractéristiques proches de la trypsine (Berrens and Maesen, 1972) sont décrites en utilisant des techniques biochimiques (dialyse, analyses enzymatique, chromatographie) et des tests sérologiques (double diffusion et immunoélectrophorèse).

L’utilisation de nouvelles techniques telles que l’isoélectrofocalisation électrique, les techniques d’électrophorèse et de western blotting bidimensionnelles (Hisauchi-Kojima et al., 1999) permettent de mieux caractériser les immunoglobulines (Boyd et al., 1982; Longbottom, 1989) ainsi que les enzymes protéolytiques (McCormick et al., 1982; McCormick et al., 1984). La mucine intestinale de pigeon (Todd et al., 1991) et d’autres protéines caractérisées selon leur poids moléculaire et leur point isoélectrique sont décrites (Calvanico, 1986; de Beer et al., 1990).

A la fin des années 2000, les protéines suspectées dans la littérature sont principalement les immunoglobulines, l’albumine sérique, la mucine intestinale, des enzymes protéolytiques et d’autres protéines caractérisées uniquement sur la base de leurs caractéristiques physico-chimique.

L’évolution récente des techniques de biologie moléculaire et l’émergence de nouvelles données dans le domaine de la Génomique et de la Protéomique permettent l’identification précise et la production de protéines « biomarqueurs » de la maladie. L’identification des protéines par spectrométrie de masse est possible seulement depuis le séquençage du génome de Columba livia (septembre 2013) (Shapiro et al., 2013).

En parallèle à ce travail de thèse, Shirai et al., ont détecté par western blot 1 D une protéine antigénique de 26 kDa révélées spécifiquement à partir des anticorps des patients PEO (7/8). Cette protéine est retrouvée à la fois dans le sérum, les fientes et le contenu intestinal de pigeon. Ils réalisent ensuite des gels 2D et des western blot 2D en utilisant le sérum et les fientes de pigeon et identifient par spectrométrie de masse les spots protéiques immuno-réactifs ayant un poids moléculaire de 26 kDa. La protéine immunoglobulin-lambda like-polypeptide -1 (IGLL1) a été identifiée dans cette étude comme biomarqueur de la maladie (Shirai et al., 2017).

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Tableau 9 : Liste des publications ayant décrit des antigènes impliqués dans la maladie du PEO.

Auteurs

(années) Espèces aviaires Matrices aviaires Source anticorps Techniques d'étude Caractéristiques des antigènes

(Edwards et

al., 1970) Pigeon

Sérum, fientes, urine, blanc d'œuf, contenu intestinal, salive, lait de jabot, plumes, fluide lacrymal

9 sérums patients PEO

Anticorps anti-γ-globuline; Anticorps anti- X-γ-globuline (antigène montrant des réactions croisées avec la γ-globuline), Anticorps anti-β-globuline,

Anticorps anti-albumine (lapins immunisés) IEP

Les protéines suivantes sont antigéniques et toutes localisées dans les fientes fraîches, le contenu intestinal et le blanc d’œuf : - γ-globuline,

- X- γ-globuline, - β-globuline, - Albumine sérique (Berrens and

Maesen,

1972) Pigeon Fientes Non renseigné

Analyses enzymatiques, chromatographie d'affinité, DD Chymotrypsine (Tebo et al., 1977) Pigeon Fientes

F1 : fraction purifiée des fientes.

5 sérums patients PEO, 5 sérums TEA,

sérums volontaires sains DD, IEP

Précipitines/fientes : sérums des patients PEO, TEA et volontaires sains.

Précipitines/fraction F1 : patients PEO et TEA (Goudswaard

et al., 1978) Pigeon Squames, lait de jabot

13 sérums PEO; 2 sérums de TEA

Anticorps anti-sérum de pigeon et anti-IgA de pigeon (lapins immunisés)

Chromatographie d'affinité,

DD, IEP IgA : protéine antigénique retrouvée dans les squames

(Fredricks,

1978) Pigeon Fientes 14 sérums PEO Anticorps anti-fientes de pigeon

DD, IEP,

Chromatographie par filtration sur gel, Analyse spectres d'absorption

Fraction F1: glycoprotéine, PM = 200 kDa = anticorps anti-X- γ-globuline (Edwards et al. 1970) = Cette protéine pourrait correspondre à l’IgA de pigeon

Fraction 3: Acide mucopolysaccharide, PM =16 kDa ; Il s’agit de la mucine.

Fraction B: glycoprotéine, PM = 42 kDa = fragment Fragment Fab ou Fc de l’IgA.

(McCormick

et al., 1982) Pigeon Fientes, Sérums, Fraction 1, Fraction 3, Fraction B

8 sérums de patients PEO, 4 sérums TEA Anticorps anti-fientes, anti-fraction-1, anti- fraction-3, anti-fraction-B (lapins

immunisés)

Chromatographie par filtration sur gel,

Isoélectrofocalisation (IEF), IEP

Fraction1 : pH isoélectrique = 3,8 Fraction 3: pH isoélectrique = 4,6 Fraction B: pH isoélectrique (pHi) = 6,1

(McCormick

et al., 1984) Pigeon

Fientes

Sérums de patients PEO et TEA

Chromatographies

échangeuse d'ions; d’affinité, par filtration sur gel, Immunoélectrophorèse croisée (XIE), Analyses enzymatiques; Electrophorèse SDS-Page

Trypsine: PM = 27,5 kDa ; Collagénases: glycoprotéines de PM = 37,1 kDa et 12,3 kDa, Estérase: PM = 51,2 kDa; Elastase : PM = 22 kDa, Phospholipase : PM = 99 kDa

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Auteurs

(années) Espèces aviaires Matrices aviaires Source anticorps Techniques d'étude Caractéristiques des antigènes

(Calvanico,

1986) Pigeon Fientes 13 sérums de patients PEO; 22 sérums TEA IEF Polypeptide, PM = 50 kDa, 3,5 < pH isoélectrique < 5

(Longbottom,

1989) Pigeon Squames, sérum, fientes, _{IgG, IgA pigeon} 5 sérums de patients PEO Anticorps anti-sérum de pigeon (lapin immunisé) Immunoélectrophorèse croisée (XIE) Electrophorèse SDS-PAGE Chromatographie d'affinité sur colonne

Protéine commune fientes-squame: IgA dégradée (PM = 28 kDa), traces d'albumine sérique

(de Beer et

al., 1990) Pigeon Sérum 9 sérums de patients PEO ; 7 sérums TEA Western blotting

Protéines suivantes = 220 kDa (9/16), 98 kDa (8/16), 86 kDa (8/16): anticorps dans sérum patients PEO et TEA Protéine de 29-32 kDa: spécifique des patients

(Todd et al.,

1991) Pigeon Intestin de pigeon 15 sérums de patients PEO ; 20 sérums TEA; 40 sérums de volontaires sains DD, ELISA

Mucine intestinale de pigeon :

Anticorps dirigés contre la mucine chez les patients PEO et TEA

(Todd et al.,

1993) Pigeon Mucus intestinal, (IgA et mucine)

32 sérums de patients PEO ; 27 sérums éleveurs d'oiseaux autres pathologies pulmonaires, 23 sérums TEA, 30 sérums de volontaires sains

ELISA Réactivité spécifique des IgG2 et IgG3 du sérum des _{patients PEO à la mucine intestinale de pigeon.}

(Hisauchi- Kojima et al.,

1999) Pigeon Fientes

Source en anticorps : liquide lavage broncho-alvéolaire (LBA)

10 LBA de patients PEO; 1 LBA de TEA; 5 LBA patients avec fièvre d'été japonaise (PHS)

Electrophorèse et western blotting 1D,

Electrophorèse 2D, western blotting 2D

Anticorps dans le sérum des patients PEO et TEA dirigés contre les protéines de PM suivantes: 199, 140, 110, 87, 60, 55, 44,40.

Anticorps dirigés contre la protéine de 21 kDa et de pH isoélectrique : 5, uniquement retrouvés dans le sérum des patients PEO. (Rouzet et al., 2014) Pigeon Perruche Poule Fientes

4 sérums de patients PEO, 2 sérums de

témoins non exposés Electrophorèse et western blotting 1D

Protéine de 68 kDa : commune pigeon et perruche Protéines spécifiques pigeon: 140 et 35 kDa Protéines spécifiques perruche: 175 kDa Protéines spécifiques poule: 200 et 100 kDa (Shirai et al.,

2017) Pigeon Fientes, sérums, Section d'intestins

8 sérums de patients PEO, 4 sérums patients autre PHS 3 sérums de volontaires sains

Western blotting 1D, IEF, Electrophorèse 2D, Spectrométrie de masse

Protéine de 26 kDa -> Immunoglobuline lambda like polypeptide 1 : IGLL1

Abréviations : PEO : poumon d’éleveur d’oiseaux ; TEA : témoins exposés asymptomatiques ; PHS : pneumopathie d’hypersensibilité ; PM : Poids Moléculaire, Ig : immunoglobuline ; IEF : immunoélectrophorèse ; DD : double diffusion ; LBA : lavage broncho-alvéolaire

55 En dépit de toutes ces recherches, le diagnostic sérologique actuel de la maladie repose sur la recherche de précipitines / anticorps IgG, dirigés contre les extraits totaux de fientes, de sérums et de plumes d’oiseaux. La plupart du temps ces antigènes sont confectionnés de manière artisanale dans les laboratoires d’analyses médicales. Les antigènes utilisés pour les analyses sérologiques (artisanaux ou commerciaux) manquent de standardisation. Ce problème pourrait être levé par l’utilisation d’antigènes recombinants. Cette stratégie de recherche de biomarqueurs s’inscrit dans une approche immuno- protéomique décrite dans la partie suivante.

3.3

Approche immunoprotéomique pour la détection de protéines