Caractérisation des échantillons mis en culture

1. Détection des marqueurs spécifiques, l’EMA et la Vimentine par immunofluorescence

Nous nous sommes assurés dans un premier temps que les cellules qui prolifèrent après leur mise en culture sont des cellules de méningiomes, et ce par détection par immunofluorescence des marqueurs Vimentine et EMA. Un co-marquage, initialement pensé, a été impossible du fait de la localisation de chacune de ces protéines, dans le cytoplasme pour la vimentine et à la surface membranaire pour l’EMA. Sur la figure 25 sont donc présentés les marquages individuels de ces deux protéines pour des cellules primaires issues de méningiomes invasifs et non invasifs.

Figure 25 : Détection des marqueurs Vimentine et EMA dans les cellules primaires de méningiomes invasifs et non invasifs

En A et B : la Vimentine apparaît en vert (A : cellules non invasives, B : cellules invasives) et l’ADN en rouge

En C et D : l’EMA apparaît en vert (C : cellules non invasives, D : cellules invasives) et l’ADN en bleu

L’acquisition des images a été réalisée avec un objectif x40. Barre d’échelle = 10 µm

Résultats L’ensemble des cellules de méningiomes mises en culture, qu’elles soient issues de méningiomes invasifs ou non invasifs, expriment bien à la fois les marqueurs Vimentine et EMA ; ce qui confirme bien le statut de tumeurs méningieales.

La deuxième étape dans la caractérisation de ces échantillons tumoraux est la confirmation du phénotype d’invasion de chaque échantillon. Pour cela, les cellules issues de méningiomes invasifs et non invasifs ont été soumises à deux tests phénotypiques in vitro.

2. Tests phénotypiques d’invasion a. Chambres de Boyden

La formation d’un ménisque lors de l’ajout de la couche de Matrigel est souvent observée et peut être critique pour une observation correcte de l’invasion. Nous avons donc testé deux conditions de séchage du Matrigel, 4 heures à 37°C et une nuit à température ambiante. Après coloration des cellules fixées sous les membranes poreuses en présence de MTT, nous avons photographié les membranes (Figure 26).

On observe, seulement pour la condition de séchage à température ambiante pendant une nuit, un regroupement cellulaire au centre de la membrane, mettant en évidence la formation d’un ménisque, l’invasion préférentielle par le centre et donc la possibilité de gêne

Figure 26 : Cellules colorées au MTT après invasion du Matrigel

50µl de Matrigel (10mg/ml) dilué au 20ème sont déposés sur la membrane poreuse puis séchés une nuit à température ambiante (A) ou 4 heures à 37°C (B).

Les cellules sont ensuite déposées dans la chambre supérieure puis les chambres de Boyden sont mises en incubation 24 heures à 37°C. Les cellules sont ensuite colorées au MTT puis observées au microscope (objectif x10) et photographiées.

Résultats pour les cellules d’envahir le Matrigel et de passer à travers les pores. La condition optimale, pour éviter les biais de mesure est donc le séchage pendant quelques heures à 37°C.

Pour les cellules issues de méningiomes invasifs et non invasifs, nous avons calculé un pourcentage de migration qui représente le nombre de cellules ayant traversé la membrane poreuse « non coatée » rapporté au nombre de cellules initialement placées dans les puits (50000 cellules). Le pourcentage d’invasion ne tient pas compte de la capacité des cellules à passer la membrane poreuse mais seulement à infiltrer et à dégrader le Matrigel qui mime la membrane basale. Le nombre de cellules ayant traversé la membrane « coatée » est donc rapporté au nombre de cellules ayant traversé la membrane « non coatée » (Figure 27). Les deux types de cellules (invasives et non invasives) présentent effectivement des phénotypes de migration et d’invasion différents, ce qui confirme les statuts invasifs et non invasifs des méningiomes obtenus du bloc opératoire.

Figure 27 : Pourcentages de migration et d’invasion des cellules primaires de méningiomes invasifs et non invasifs

0%   20%   40%   60%   80%   100%   0%   20%   40%   60%   80%   100%  

Pas  de  matrigel   1/40   1/20   1/10  

%   d' in va si on   %   de  m ig ra 6o n   Invasives Non invasives Invasives Non invasives

Résultats On remarque cependant que seules les dilutions 1/20 et 1/40 permettent de distinguer l’invasion des deux types cellulaires alors que la dilution 1/10 n’est pas adaptée pour ce test phénotypique.

Concernant le comptage des cellules ayant traversé la membrane poreuse, plusieurs méthodes ont été décrites comme la coloration des cellules et le comptage manuel au microscope mais nous avons choisi le test MTT plus fiable et moins contraignant. Cependant,

nous avons eu l’opportunité de tester le système xCelligence RTCA DP (Roche^®), qui permet

une mesure d’impédance en temps réel et en continu mais qui a également l’avantage de ne pas nécessiter de marquage et donc de garder les cellules en condition native.

b. Système de mesure d’impédance

Trois quantités cellulaires (5000, 10000 et 20000 cellules) ont été testées sur plaque E-plate 16 pour déterminer le nombre optimal de cellules à utiliser par la suite pour le test d’invasion sur CIM-plate 16. Les index cellulaires ont été mesurés au cours du temps à la fois pour les cellules invasives et non invasives (Figure 28).

Figure 28 : Profils des index cellulaires normalisés en fonction du temps obtenus sur E-plate 16

Tracés bleu et violet : 5000 cellules (Bleu : non invasives ; Violet : invasives) Tracés verts : 10000 cellules (Vert foncé : non invasives ; Vert clair: invasives) Tracés rouge et rose : 20000 cellules (Rouge : non invasives ; Rose : invasives) Tracé noir : Contrôle négatif

Résultats L’impédance cellulaire mesurée dépend à la fois du nombre de cellules ayant adhéré sur les électrodes d’or mais également de la capacité d’adhésion et de la morphologie, notamment de la taille des cellules. Pour la condition de 20000 cellules, une diminution de l’index cellulaire est observée après 10-12 heures d’incubation indiquant une rétractation possible des cellules due à une confluence cellulaire trop importante. Concernant la condition de 5000 cellules, les index cellulaires indiquent bien une augmentation de la prolifération cellulaire mais ces valeurs d’index cellulaires étant relativement faibles, nous avons choisi comme condition optimale la condition de 10000 cellules.

L’invasion des cellules invasives a été testée sur quatre dilutions de Matrigel (1/3, 1/10, 1/20 et 1/40) en présence de SVF, jouant le rôle de chimioattractant (Figures 29 A et B). Sur la figure 29 A sont présentés les index cellulaires en fonction du temps et ces profils ne présentant pas de plateau tout au long des 24 heures d’incubation, il nous a été possible de présenter les résultats sous forme de pente pour chaque courbe (Figure 29 B). On remarque d’une part que les dilutions 1/3 et 1/10 ne permettent pas de laisser les cellules ayant une forte capacité invasive à dégrader le Matrigel et à passer la membrane poreuse puisque les index cellulaires sont proches du bruit de fond. Quant à la dilution 1/40, elle semble être également peu adaptée pour l’étude phénotypique sur cellules invasives puisque les index cellulaires sont proches de la condition sans Matrigel. Quant aux conditions sans chimioattractant, on observe

comme attendu une diminution nette de l’invasion.  

A   B  

Figure 29 : Etude du phénotype invasif de cellules invasives sur différents « coatings » de Matrigel en présence ou non de chimioattractant

A : Profils d’index cellulaires en fonction du temps pour des cellules invasives sur différents « coatings » de Matrigel (dilutions au 1/3, 1/10, 1/20 et 1/40) en présence de SVF.

Résultats Si on compare la migration (pas de Matrigel) et l’invasion (dilutions 1/20 et 1/40) de cellules issues de méningiomes invasifs et de cellules non invasives issues de cancer du sein (MCF7) ou issues de méningiomes, on remarque une nette différence entre cellules invasives et non invasives (Figure 30). Le fait que la dilution 1/40 ne soit pas adaptée puisque trop proche de la condition « sans Matrigel » est également confirmée pour les cellules non invasives. On peut également observer que les cellules non invasives de méningiomes ont une capacité migratoire supérieure à celle des cellules non invasives MCF7.