4. Les*cancers*MSI*sporadiques*
!
Les!cancers!MSI!sporadiques!sont!de!loin!ceux!qui!ont!été!les!mieux!étudiés!jusqu’alors.!Ils! représentent! 10%! environ! des! cancers! sporadiques! du! côlon,! de! l’estomac! et! de! l’endomètre!34.!Dans!ces!cancers,!il!est!assez!rare!de!mettre!en!évidence!des!mutations! sur! la! séquence! codante! des! gènes! MMR,! notamment! MLH1! et! MSH2,! alors! que! telles! altérations!sont!retrouvées!dans!la!majorité!des!cas!de!cancers!familiaux!du!côlon!Lynch.! Néanmoins,!de!telles!mutations!(altérations!biSalléliques!et!somatiques!sur!un!gène!MMR)! ont!été!récemment!rapportées!en!nombre!au!niveau!de!patients!avec!un!cancer!colorectal! MSI! et! sans! mutation! germinale! identifiée!26.! Une! des! grandes! caractéristiques! de! ces! tumeurs,!par!rapport!aux!cancers!MSI!héréditaires,!reste!l’inactivation!du!gène!MLH1!par! méthylation!biallélique!de!son!promoteur!25,!associée!à!une!perte!de!l’expression!de!ce! gène.!Le!premier!article!faisant!état!de!la!méthylation!du!promoteur!de!MLH1!fût!publié! en!1997!23.!Seule!la!méthylation!de!la!région!proximale!du!promoteur!de!MLH1!induit!un! silencing!du!gène.!Si!la!méthylation!se!situe!dans!la!région!distale,!il!n’y!aura!pas!d’impact! sur!l’expression!de!ce!gène!35.! Table*4*:*Critères*de*Bethesda.* *!!Lymphocytes!infiltrant!la!tumeur!(TIL),!réaction!lymphocytaire!de!type!Crohn,!cellules!mucineuses!en! bague!à!chaton!ou!aspect!moléculaire.!D’après&Umar&A&et&al.,&JNCI,&2004.!
5. Caractéristiques*cliniques*des*tumeurs*MSI**et*méthodes*diagnostiques* *
a. Caractéristiques*cliniques*et*pronostiques* *
Les!CCR!MSI!sont!connus!pour!avoir!des!caractéristiques!clinicoSpathologiques!distinctes.! La! différence! entre! les! CCR! MSI! et! les! CCR! MSS! ne! se! limite! pas! uniquement! aux! caractéristiques! moléculaires.! En! effet,! d’un! point! de! vue! clinique,! les! CCR! MSI! ont! une! initiation! tumorale! rapide! et! une! progression! tumorale! plus! lente,! sont! des! tumeurs! volumineuses! localisées! principalement! dans! le! côlon! proximal!9,!11,! peu! différenciées,! mucineuses,!présentant!une!forte!infiltration!lymphocytaire!36,!37.!! * Les!CCR!MSI!sont!plus!fréquemment!de!stade!II!que!de!stade!III!(avec!une!infiltration!des! ganglions!lymphatiques),!et!sont!rarement!de!stade!IV!(cancer!métastatique!à!distance).! De!plus,!les!cancers!colorectaux!MSI!sont!détectés!plus!fréquemment!chez!la!femme!que! chez!l’homme!(forme!sporadique!de!la!maladie,!sexe!ratio!de!2!pour!1).! ! Gryfe!et&al.!ont!été!les!premiers!à!montrer!sur!une!cohorte!de!CCR!MSS!et!MSI!que!les! tumeurs!MSI!avaient!un!meilleur!pronostic!que!les!tumeurs!MSS!et!qu’elles!étaient!moins! à!même!de!métastaser!dans!les!ganglions!lymphatiques!ou!à!distance!38.!Plus!récemment,! une! métaSanalyse! réalisée! par! Popat! et& al.,& regroupant! les! données! de! 32! études! différentes! (soit! au! total! 7642! patients! dont! 1277! avec! des! CCR! MSI)! a! confirmé! de! manière! significative! l’avantage! pronostique! de! ces! tumeurs! 39.! En! revanche,! il! a! récemment!été!décrit!que!les!CCR!MSI!métastatiques!(stade!IV)!ne!sont!pas!associés!à!une! meilleure!survie!par!rapport!aux!cancers!MSS!de!même!stade!et!que!la!mutation!BRAFV600E! semblent!être!un!facteur!de!mauvais!pronostic!dans!ces!cancers!40.! ! b. Marqueurs*pronostiques* !
Plusieurs! facteurs! moléculaires! ont! été! mis! en! évidence! comme! pouvant! influencer! le! pronostic!des!cancers!colorectaux!41,!42,!43,!44!(Figure*4).!Ces!facteurs!incluent!la!déficience! du! système! MMR,! le! phénotype! CIMP! ainsi! que! les! mutations! des! oncogènes! BRAF! et!
fréquemment! une! mutation! activatrice! V600E! sur! l’exon! 15! de! l’oncogène! BRAF&45.! Les! mutations!BRAFV600E!sont!exclusives!des!mutations!au!niveau!des!codons!12!et!13!de!KRAS&
46,!détectées!dans!30S40%!des!CCR!en!général!47.!BRAF!est!muté!dans!environ!35%!des! tumeurs!MSI!et!5%!des!tumeurs!MSS!colorectales.! ! Depuis!peu,!de!nouvelles!classifications!des!CCR!sont!apparues,!prenant!en!compte!des! caractéristiques!plus!globales!grâce!à!des!approches!omiques&(technologies!permettent!de! générer!des!quantités!énormes!de!données!à!des!niveaux!multiples)!48,!49,!50.!!
En! exemple,! l’étude! de! Marisa! L! et& al.,! classifie! les! cancers! colorectaux! en! 6! catégories! allant!de!C1!à!C6!(Figure*4).!Les!cancers!de!la!classe!C4!et!C6!ont!un!plus!mauvais!pronostic! que!les!autres!(Figure*4).!
! ! !
c. Méthodes*diagnostiques*
Il!est!maintenant!généralement!admis!que!la!détermination!du!statut!MSI!des!tumeurs!est! utile!car!il!permet!d’identifier!les!patients!Lynch!(critères!familiaux!et/ou!cliniques!utilisés! jusqu’à!présent!peu!sensibles!ou!peu!spécifiques).!!
Suite! à! la! découverte! du! phénomène! d’instabilité! des! microsatellites,! le! National! Cancer! Institute! organise! en! décembre! 1997! «! The! international! Workshop! on! Microsatellite! Instability!and!RER!phenotypes!in!Cancer!Detection!and!Familial!Predisposition!»!au!cours! duquel!il!a!été!proposé!un!panel!de!5!microsatellites!pour!déterminer!le!statut!MSI!d’un! cancer!34.!
Figure*4*:*Marqueurs*pronostiques*de*MSI.*
A)!Classification!moléculaire!des!cancers!colorectaux!en!fonction!du!statut!CIMP!(H:!High,!L:!Low,!Neg:! negative)! et! MSI.! D’après& Jass& et& al.,& Histopathology,& 2007.! Le! cercle! rouge! indique! le! pronostic! des! tumeurs!en!fonction!de!leur!classification.!D’après&Sinicrope&F&et&al.,&Gastroenterology,&2014.!
B)!Principales!caractéristiques!des!6!classes!de!cancers!colorectaux!obtenues!par!analyse!du!génome!et! du! transcriptome.! dMMR:! MMR! déficient;! CSC:! cellules! souches! cancéreuses;! KRASm:! KRAS! muté;! CINnorm:! expression! normale! des! gènes;! CINWntUp:! surSexpression! de! la! voie! Wnt;! CINImmuneDown:! sousS expression! de! la! voie! immune;! o:! fréquence! très! basse;! +++:! haute! fréquence:! +/++:! fréquence! intermédiaire.!Les!flèches!indiquent!la!sur!ou!sousSexpression!des!gènes!correspondant!à!chaque!voie;! EMT:! Epithelial! Mesenchymal! Transition;! SC:! Stem! Cell;! Wnt! pw:! Wnt! pathway.! D’après& Marisa& et& al.,&
PlosMedicine,&2013.! ! ! ! ! !
* •*Diagnostic*par*une*approche*de*PCR*
Le!principe!de!la!caractérisation!MSI!repose!sur!l’analyse!des!produits!d’amplification!par! PCR! de! plusieurs! régions! non! codantes! contenant! des! microsatellites,! de! manière! comparative! dans! l’ADN! tumoral! et! l’ADN! normal! d’un! même! patient.! Le! panel! recommandé!lors!de!la!réunion!de!consensus!de!Bethesda!est!composé!de!5!microsatellites! :! 2! marqueurs! mononucléotidiques! (BAT25! et! BAT26)! et! 3! marqueurs! dinucléotidiques! (D5S346,!D2S123!et!D17S250)!(Figure*5).!Par!définition,!une!instabilité!sur!au!moins!2!de!ces! 5! marqueurs! caractérise! une! tumeur! MSISH! (pour! MSISHigh).! Les! tumeurs! ne! présentant! une!instabilité!que!sur!un!seul!marqueur!sont!MSISL!(pour!MSISLow).!Les!tumeurs!MSS!sont! celles!ne!présentant!aucune!instabilité!sur!les!5!microsatellites.!Il!n’a!jamais!été!obtenu!de! preuves! évidentes! et! définitives! de! l’existence! réelle! du! phénotype! MSISL! qui! ne! se! distingue!pas,!ou!peu!et!de!manière!très!controversée,!du!phénotype!MSS.!!
Les! critères! pour! reconnaître! les! tumeurs! MSI! ont! été! révisés! en! 2002,! à! la! suite! de! plusieurs! études! mettant! en! évidence! un! certain! nombre! de! défauts! du! premier! panel! proposé,! du! fait! notamment! de! l’utilisation! de! marqueurs! dinucléotidiques!33.! Le! panel! original! de! Bethesda! n’est! pas! déconseillé,! mais! il! est! maintenant! suggéré! d’utiliser! en! priorité!des!marqueurs!mononucléotidiques!pour!identifier!les!tumeurs!MSI.!Un!panel!de!5! marqueurs!mononucléotidiques!(BAT25,!BAT26,!NR21,!NR24!et!NR27),!proposé!par!notre! équipe!51,!a!pu!être!ainsi!recommandé!33!(Figure*5).!
Outre!une!extrême!sensibilité!et!spécificité,!ce!dernier!panel!a!l’avantage!d’être!constitué! de! marqueurs! quasiSmonomorphes! (c’estSàSdire! présentant! très! peu! de! polymorphismes! de! taille! dans! les! ADNs! normaux)! dans! la! population! mondiale,! si! bien! que! l’analyse! comparative! de! l’ADN! constitutionnel! des! patients! n’est,! en! règle! générale,! pas! requise.! Dans! ce! contexte,! comme! il! existe! tout! de! même! quelques! variants! alléliques! de! ces! marqueurs,! une! tumeur! ne! doit! être! considérée! comme! MSI! que! si! elle! montre! une! instabilité! au! niveau! de! 3! au! moins! de! ces! 5! microsatellites! mononucléotidiques.! Pour! certaines!localisations!tumorales,!dans!lesquelles!l’instabilité!des!microsatellites!est!moins! prononcée,!conduisant!de!fait!à!des!variations!de!tailles!de!ces!marqueurs!plus!discrètes!et! donc! plus! difficiles! à! identifier! (endomètre! par! exemple),! une! comparaison! avec! l’ADN! normal!correspondant!des!patients!reste!recommandée!52.!
* •*Diagnostic*par*une*approche*d’immunohistochimie*
Une!alternative!à!l’allélotypage!de!microsatellites!est!l’immunohistochimie.!Elle!permet!la! détermination! indirecte! du! statut! MSI! des! échantillons! étudiés! par! la! mise! en! évidence! d’une!perte!d’expression!au!niveau!d’une!des!protéines!du!système!MMR!dans!la!cellule! tumorale,!les!cellules!normales!contaminantes!ou!infiltrantes!faisant!fonction!de!contrôle! interne!d’expression.!Pour!être!complète,!cette!analyse!nécessite!l’emploi!de!4!anticorps! dirigés!contre!MLH1,!MSH2,!MSH6!et!PMS2!(Figure*5).!Cette!démarche!méthodologique!est! considérée! comme! étant! moins! lourde! et! moins! coûteuse! que! l’allélotypage! des! microsatellites,! et! elle! est! utilisée! en! routine! dans! de! nombreux! laboratoires! d’anatomopathologie! pour! faire! le! diagnostic! MSI! des! tumeurs.! L’immunohistochimie! ne! permet!pas!néanmoins!l’identification!des!cas!porteurs!d’une!mutation!faux!sens,!pouvant! entraîner! pourtant! une! perte! de! fonction! d’un! gène! MMR,! sans! diminuer! systématiquement! le! taux! d’expression! du! gène! concerné.! L’immunohistochimie! a! l’avantage! de! cibler! chaque! perte! MMR,! et! elle! facilite! donc! la! recherche! de! mutations! constitutionnelles!de!ces!gènes!dans!les!familles!Lynch.!!
Ces! deux! approches! (PCR! microsatellite! et! immunohistochimie! MMR)! sont! utilisées! en! routine!à!l’hôpital!SaintSAntoine!et!sont!les!2!méthodes!de!référence!à!l’international!pour! identifier!le!phénotype!MSI!ou!MSS!d’un!cancer.!
!
Figure*5*:*Mise*en*évidence*du*phénotype*MSI.*
A)!et!B)!Mise!en!évidence!par!amplification!de!5!marqueurs.!MSI!est!détectable!par!autoradiographie!après! électrophorèse! des! produits! PCR! (A)! ou! par! électrophorèse! capillaire! avec! des! amorces! fluorescentes! (B).! Les! délétions! se! manifestent! par! l’apparition! de! bandes! ou! de! pics! supplémentaires! (flèches).! N:! tissu! normal;!T:!tissu!tumoral.!D’après&Boland&et&al.,&Gastroenterology,&2010.!
C)!Mise!en!évidence!par!immunohistochimie.!Exemple!d’une!tumeur!colique!MSI!ayant!perdu!l’expression! des!protéines!1)!MLH1!et!2)!PMS2,!mais!conservé!l’expression!des!protéines!3)!MSH2!et!4)!MSH6.!N:!tissu! normal;!T:!tissu!tumoral.!D’après&Svreck&et&al.,&JCO,&2007.&!