Conclusion and in course project
B) Calpaïnes intra et extracellulaires et oncogenèse
Dans le cadre d’un premier travail, il avait pu être démontré que les calpaïnes jouent un rôle complexe dans l’oncogenèse, en utilisant pour cela un modèle de mélanome murin194. En inhibant spécifiquement l’activité des calpaïnes par la surexpression de la calpastatine soit dans le mélanome injecté aux souris, soit dans l’animal recevant cette tumeur (modèle CalpTG décrit précédemment), un rôle à la fois pro- et anti-tumoral des calpaïnes a ainsi été mis en évidence. En effet, les calpaïnes favorisent la prolifération des mélanocytes ainsi que la néo-angiogenèse induite par les tumeurs, ce qui augmente le développement tumoral. Toutefois, les calpaïnes augmentent également l’apoptose des cellules tumorales, du moins dans ce modèle, et les cellules sur-exprimant la calpastatine échappent au processus d’apoptose, favorisant le développement de métastases probablement en partie par ce biais. D’autre part, la réponse immune anti-tumorale est affectée par l’inhibition des calpaïnes intracellulaires.
Dans ce premier travail, seules les calpaïnes intracellulaires avaient été envisagées comme un médiateur potentiel de la tumorigenèse. La prise en considération d’un rôle propre des calpaïnes extracellulaires dans le développement tumoral a fait l’objet d’un travail spécifique présenté ici.
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Comme détaillé dans l’introduction, l’équipe d’accueil a mis en évidence un rôle spécifique des calpaïnes externalisées dans le contrôle de la réponse immune qui est, par bien des aspects, opposé au rôle des calpaïnes intracellulaires268. Il a pu être montré que les calpaïnes intracellulaires peuvent être externalisées hors des cellules et notamment des lymphocytes par le transporteur ABCA1, peut être par la formation de microparticules (phénomène de flip-flop membranaire). Hors des cellules, les calpaïnes clivent TLR2, un récepteur impliqué dans la réponse immune et notamment la production d’interleukine-17A73. Les calpaïnes extracellulaires bloquent ainsi cette réponse. Grâce au développement d’une souris transgénique qui surexprime uniquement la calpastatine extracellulaire, synthétisée par le foie en réponse aux stimuli inflammatoires, sécrétée puis circulant dans le sang (souris CRP-Calpast), l’équipe d’accueil a pu démontrer que l’inhibition des calpaïnes extracellulaires jouait un rôle pro-inflammatoire in vivo (alors que l’inhibition des calpaïnes intracellulaires joue un rôle anti-inflammatoire). Or, une réponse immune appropriée et notamment l’activation de TLR2 sont nécessaires pour une réponse anti-tumorale adaptée 245.
Dans un premier temps, nous avons testé à l’aide du modèle d’injection de mélanome sous-cutané si l’inhibition des calpaïnes extracellulaires uniquement pouvait favoriser le développement tumoral et en effet, le volume tumoral ainsi que le poids du mélanome 15 jours après l’injection étaient moindre chez les souris CRP-Calpast, qui présentaient un infiltrat inflammatoire, notamment de lymphocytes T CD8+, plus important dans les tumeurs analysées, suggérant une réponse anti-tumorale accrue. Nous avons d’autre part, pu mettre en évidence que l’expression de TLR2 intact était préservée dans les tumeurs de ces animaux, ce qui confirme le rôle clé des calpaïnes dans le clivage de ce récepteur. Enfin, les cytokines induites par les voies de signalisation en aval de TLR2 étaient augmentées chez les animaux CRP-Calpast. Afin de confirmer que les effets sur la croissance tumorale impliquaient bien TLR2, nous avons effectué des expérimentations complémentaires en injectant à intervalles réguliers un agoniste de TLR2, le Pam3Cys. L’injection de cet agoniste a permis de réduire la croissance des tumeurs chez tous les animaux mais proportionnellement encore plus chez les animaux transgéniques qui ont une expression conservée de TLR2, ce qui suggère un rôle important de TLR2 dans cette réponse anti-tumorale. Ces travaux étaient motivés par la recherche de nouveaux traitements anti cancéreux et aux vus de nos résultats, nous avons envisagé que des drogues permettant de bloquer l’efflux des calpaïnes hors des cellules par le transporteur ABCA1 puissent apporter un bénéfice anti-tumoral. Nous avons testé in vitro et in vivo les effets du probénécide qui possède de tels effets. In vitro, le
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probénécide diminue l’efflux de calpaïnes hors des splénocytes et préserve ainsi l’expression de TLR2 à leur surface. In vivo, l’injection répétée de probénécide a eu un effet spectaculaire en termes de limitation de la croissance tumorale.
Ainsi, alors que l’inhibition globale des calpaïnes apparait comme difficilement applicable en thérapeutique, l’utilisation de drogues permettant de moduler l’efflux de calpaïnes pourrait être utile, en diminuant cet efflux dans le cadre du cancer, ou en le provoquant dans le cadre de traitements anti-inflammatoires.
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2) Perspectives
A) Calpaïnes et vieillissement
Dans le cadre des travaux sur le rôle des calpaïnes au cours du vieillissement, nous nous sommes focalisés sur le rôle de l’inflammation ou inflammaging. Ceci était motivé principalement par les observations des tissus et notamment du tissu rénal, et par les profils d’expression du génome dans le cortex rénal. Il est toutefois envisageable que d’autres mécanismes soient impliqués et nous avons obtenu des résultats le suggérant.
Des travaux antérieurs basés sur des analyses protéomiques ont montré que les souris déficientes en Klotho, affectées par un vieillissement précoce, ont une protéolyse accrue de l’alpha-spectrine, qui s’est avérée liée à une activité accrue de la calpaïne µ 149. Nous avons pu mettre en évidence in vitro que l’addition de la protéine Klotho recombinante sur des cellules épithéliales rénales permettait de bloquer l’activation des calpaïnes par l’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), ce dernier étant un médiateur reconnu du vieillissement (Annexe 1 : A,B)152. D’autre part, la culture de cellules épithéliales tubulaires provenant de souris CalpTG et de souris contrôles a permis de montrer que la réponse proliférative à l’IGF-1 était diminuée dans les cellules issues des souris transgéniques, témoignant du rôle des calpaïnes dans la réponse cellulaire à l’IGF-1 (Annexe 1 : C). Ces observations in vitro nécessiteront des expérimentations in vivo complémentaires afin d’identifier la régulation par Klotho et IGF-1 de l’activité calpaïne et leur implication éventuelle dans les processus de vieillissement.
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