c) Interprétation

L’effet du RNAi de dUSP36 est réprimé dans tous les cas par chacun des éléments de la voie Imd. Ceci indique que, d’une part, le phénotype induit par l’inactivation de dUSP36 résulte, au moins en partie, de la dérégulation de la voie Imd et que d’autre part, dUSP36 agit en amont de la voie. Sachant qu’Imd est la cible de dUSP36 (voir article Thevenon et al.), on ne s’attendait pas à observer un effet suppresseur du RNAi de PGRP-LC. Cependant mes expériences en cellules S2 suggèrent que la formation d’un complexe PGRP-LC/Imd est strictement requise à l’activation de la voie (voir article Engel et al., figure 2). En effet, lorsqu’on exprime Imd en cellules de drosophile on induit l’activation de la voie, cette activation est abolie si on inhibe l’expression de PGRP-LC par ARN interférence. PGRP-LC doit donc être présent pour assurer la transduction du signal par Imd. Ceci nous a conduits à l’hypothèse suivante : Imd ne peut induire la voie que sous forme complexée à PGRP-LC.

L’effet de l’inactivation de dUSP34 est atténué par l’inactivation de dTAK1 et PGRP- LC. Ceci montre que le phénotype dû à l’extinction de dUSP34 dépend de la voie Imd. Comme l’inactivation d’Imd ne sauve pas le phénotype induit par l’inactivation de dUSP34, dUSP34 pourrait agir en aval d’Imd et amont de dTAK1. Dans ce cas, l’effet suppresseur de l’inactivation de PGRP-LC pourrait résulter d’un rôle de PGRP-LC en tant que protéine

MS1096 > MS1096 USP2-IR Lignée pWIZ- dUSP2-5M USP2-IR Lignée pWIZ- dUSP2-1M USP2-IR Lignée VDRC ID37929 USP2-IR Lignée VDRC ID37930 USP34-IR Lignée VDRC ID27517 USP36-IR Lignée pWIZ- dUSP36 wi10cs Pas de phénotype Ailes courbées (Cyo) et fripées Légère courbure (Cyo) Ailes courbées de façon longitudinale Ailes courbées de façon longitudinale Légère courbure (Cyo) et défauts de veines Ailes très courbées (Cyo), parfois fripées ou atrophiées Imd-IR Pas de phénotype

Ø Ø Ø sup léger Ø sup

dTAK1-IR Pas de phénotype

d’échafaudage dans un complexe incluant, non seulement Imd, mais aussi dTAK1. Pour vérifier cette hypothèse, il faudrait tester l’effet du RNAi de PGRP-LC sur l’induction de la voie obtenue par la surexpression de dTAK1. On cherchera aussi à tester si l’induction de la voie Imd par dTAK1 disparaît en cas d’extinction d’Imd par ARN interférence.

Concernant dUSP2, il est difficile de le situer dans la voie Imd à partir de ces expériences d’interaction génétique in vivo. D’une expérience et d’une lignée IR à l’autre, les effets phénotypiques ne sont pas toujours significatifs. Mes expériences de biochimie suggèrent néanmoins qu’Imd est la cible de dUSP2 (voir article Engel et al., figure 7 et ci- dessous).

La recherche du niveau d’activation de dUSP2 et dUSP34 dans la voie Imd se poursuivra par de nouvelles expériences d’interaction génétique in vivo portant cette fois sur l’expression de la Dipt qui reflète mieux la réponse immunitaire par rapport à un phénotype de développement. Dans ces expériences nous testerons si la dérégulation constitutive de la Dipt observée dans les lignées dUSP2-IR et dUSP34-IR dépend de Imd et/ou de dTAK1 dans des mouches dUSP-IR ; Imd-IR et dUSP-IR ; dTAK1-IR. En parallèle nous poursuivrons des expériences de biochimie, de Pull-down et de co-immunoprécipitation, afin de rechercher les partenaires et substrats de ces deux USPs. D’ores et déjà, les expériences de co- immunoprécipitation indiquent que dUSP2 interagit avec Imd. Concernant dUSP34, le cDNA de ce gène n’étant pas disponible, il n’a pas été possible de tester ces interactions avec les éléments de la voie Imd. Comme dUSP34 agit également sur la voie Toll, il serait tentant d’imaginer qu’il a un effet sur un élément commun aux voies Toll et Imd. Cependant, un tel élément n’a pas encore été identifié (hormis Relish dont dépendent les voies Toll et Imd en cellules S2 (Tanji et al., 2007 ; Engel et al.)). Certaines expériences suggèrent que dTRAF2 agit sur la voie Toll (Shen et al., 2001) et sur la voie Imd (Cha et al., 2003). Par homologie avec son orthologue humain, TRAF6, dTRAF2 pourrait s’auto-ubiquitiner et participer ainsi à l’activation des facteurs NF-κB. En déubiquitinant dTRAF2, dUSP34 pourrait réguler négativement les voies Toll et Imd. Cependant, le rôle de dTRAF2 dans les voies Toll et Imd donne lieu à une controverse (Leulier et al., 2006) et ces hypothèses concernant le rôle de dUSP34 sur cette protéine restent encore très spéculatives.

II.3.2. Localisation de dUSP2 en cellules S2

Afin de déterminer la localisation cellulaire de dUSP2, j’ai construit un vecteur permettant l’expression de l’isoforme dUSP2-PA (codée par dUsp2-RA, voir annexe 2) en fusion avec un tag myc (dUSP2-myc). J’ai transfecté cette construction en cellules S2 de drosophile et observé au microscope confocal la localisation de dUSP2-PA. Dans ces cellules, dUSP2-PA se distribue de façon ponctuée et homogène, aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau (figure 24). La localisation cytoplasmique de dUSP2-PA est en accord avec son rôle dans la voie Imd.

A

A’

A’’

B

B’

B’’

Figure 24. Localisation de dUSP2en cellules S2 de drosophile. Visualisation de la protéine dUSP2 étiquetée

myc (rouge) (A), du noyau (bleu) (A’) et superposition des deux marquages (A’’). Zoom de deux cellules (B, B’ et B’’). dUSP2-myc est distribué en petits amas de façon homogène dans la cellule. Les cellules S2 sont cultivées sur lame cc2 (LAB-TEK, Nalge Nunc International) dans du milieu DSM-10% SVF. Les transfections transitoires sont réalisées avec 50ng de pAc-dUSP2-myc, en présence de TransFectin Lipid Reagent (Bio-Rad). 96 heures après la tranfection, les cellules sont fixées à température ambiante au paraformaldéhyde 4%, et perméabilisées avec 0,2% Triton X-100. La localisation de dUSP2 est déterminée grâce à un anticorps anti-myc (Cell signaling technology) dilué au 1/500, puis un anticorps secondaire couplé à la cyanine 3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) dilué au 1/1000. Marquage de l’ADN (bleu) au Hoescht (1µg/ml). Montage avec du FluorSave (Calbiochem), observation au Microscope confocal (objectif x63). Barres d’échelle : 20 et 5µ m.

Dans le but de déterminer plus précisément la localisation de dUSP2, j’envisage de construire une lignée P{UAS-dUSP2-myc} qui me permettra d’observer la protéine étiquetée in vivo et plus particulièrement dans le corps gras. Par ailleurs, nous allons poursuivre les

études de marquages en cellules S2 à l’aide de nouvelles constructions de chacune des isoformes de dUSP2 en fusion avec des étiquettes « myc » ou « flag ».

Afin de définir si dUSP2-myc colocalise avec Imd, j’ai observé la localisation d’Imd endogène dans les cellules S2 grâce à un anticorps anti Imd. La protéine Imd endogène se localise de façon très homogène dans les cellules et je n’ai pas observé de colocalisation avec dUSP2-myc. Il serait intéressant de tester si la localisation d’Imd est modifiée en cas d’infection, en mettant les cellules en contact avec des bactéries E. coli tuées par choc thermique. Il serait également pertinent de tester si, en cas d’infection, Imd colocalise avec dUSP2-myc. Ces co-marquages permettraient de renforcer la caractérisation fonctionnelle de dUSP2 dans la voie Imd.