Biomarqueurs choisis pour l’étude

Le glutathion réduit est un tripeptide (L -γ-glutamyl-L-Cysteinyl glycine) qui joue un rôle central dans les processus de défense antioxydant intracellulaire (Arrigo, 1999 ; Sies, 1999). Ce tripeptide constitue le composé thiol majeur intracellulaire ; il joue, grâce à son groupement thiol de la cystéine, un rôle important dans la protection des structures cellulaires et tissulaires (Yo et al., 1993 ; Michelet et al., 1995).De plus, le glutathion réduit est un cofacteur de plusieurs enzymes, qui catalysent la détoxification et l’excrétion de plusieurs composés toxiques. Parmi ces enzymes la glutathion peroxydase (GPx) réduit les hydroxydes en alcools primaires, la glutathion synthétase intervient dans la biosynthèse du GSH, et enfin, la glutathion -S-transférase (GST) intervient dans les réactions de conjugaisons des électrophiles (Saint-Denis et al., 1998).

Le GSH a la capacité de réduction et c’est un donneur de proton aux peroxydes. Ces derniers sont transformés alors en alcools primaires non toxiques et solubles dans l’eau. Cette réaction est catalysée par la GPx (Bast et Haenen, 1984 ; Pierce et Tappel, 1987).

Suite à cette réaction, le GSH est oxydé en glutathion oxydé (GSSG) ce qui provoque la diminution du taux de GSH dans la cellule. Dans les réactions de conjugaison, le GSH joue le rôle d’un nucléophile via son groupement (-SH), ces réactions sont catalysées par la GST

(Chasseaud, 1976 ; Addams et al., 1983).

La fonction antioxydante du GSH est représentée dans la figure 2 : Le peroxyde d'hydrogène, résultant d'un métabolisme aérobique, peut être métabolisé par la GSH- peroxydase dans le cytosol et la mitochondrie et par la catalase dans le peroxysome. Le GSSG formé est réduit en GSH par la GSSG réductase aux dépens du NADPH, formant ainsi un cycle redox. Les peroxydes organiques (ROOH) peuvent être réduits par la GSH peroxydase ou la GSH S-transférase. En cas de stress oxydatif grave, la capacité de la cellule à réduire le GSSG en GSH peut être dépassée, entraînant une accumulation de GSSG. Pour éviter une modification de l'équilibre rédox, le GSSG peut soit être activement transporté hors de la cellule, soit réagir avec une protéine sulfhydryle (PSH) pour former un disulfure mixte (PSSG) (Shelly et Lu, 2009).

6. 2. Glutathion-S transférase : enzyme de phase II de biotransformation

Les glutathion-S transférases (GST) représentent une famille d'enzymes multifonctionnelles essentiellement cytosoliques, impliquées dans des opérations diverses de transport et de biosynthèse intracellulaires (George, 1990). Toutefois, la fonction des GST la plus étudiée, concernant les programmes de suivi environnementaux, demeure leur activité de catalyse des réactions de conjugaison entre des groupements hydrophiles endogènes (glutathion), et des molécules réactives comportant des sites électrophiles, capables de réagir avec des macromolécules comme les acides nucléiques (ARN, ADN). A ce titre, les GST font partie des mécanismes de défense des cellules contre des stress chimiques et sont qualifiées d’enzymes de phase II parce qu’elles interviennent généralement à la suite des enzymes de phase I (cytochrome P450) qui oxydent les xénobiotiques les rendant parfois plus actif biologiquement (ex HAPs).

La phase de conjugaison concerne aussi bien des molécules endogènes que des xénobiotiques comme les PCBs, les HAPs et les pesticides (Aarab, 2004).

Les GST ont été mises en évidence dans la plupart des êtres vivants tels que la levure

(Foley et Sheehan, 1998), les Mollusques (Blanchette et Singh, 1999), les Crustacés (Keeran et Lee, 1987; Le Blanc et Cochrane, 1987), les poissons (George et Young, 1988; Martinez- Lara et al., 1997; Perez-Lopez et al., 2000), les mammifères (Habig et al., 1974; Kamisaka et

al., 1975) et les plantes (Hong et al., 1999). Leurs intérêt est dès lors exploité en écotoxicologie environnementale dans de nombreux études, entant qu'enzyme témoignant d'un stress oxydant ou de présence de contamination organique dans le milieu de vie, notamment chez les organismes aquatiques.

6. 3. Catalase

La catalase est une enzyme tétramérique, chaque unité portant un groupement prosthétique (hème) et une molécule de NADPH. Cette enzyme est présente chez tous les organismes aérobies. Chez les eucaryotes elle est principalement située dans le cytosol et dans les peroxysomes où elle catalyse la réduction du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire (Cossu et al., 1997a). Le H2O2 est un précurseur du radical hydroxyle, et

est une espèce réactive à l’oxygène (ROS) qui induit des dommages d’ADN (Baumard et al., 1999; Halliwell et Gutteridge, 1999). Au regard de son mode d’action et de sa localisation peroxysomale, la catalase est décrite comme complémentaire de la GPx dans l’élimination du H2O2 et la protection contre la peroxydation lipidique. La catalase est sensible à certains

contaminants inducteurs de stress oxydatif au niveau des membranes cellulaires, comme les HAPs, les PCBs et certains pesticides (Solé et al., 1995b). L’activité catalase est largement étudiée chez plusieurs espèces et différents groupes zoologiques (mollusques, insectes, mammifères...) comme un marqueur de stress oxydatif. Elle varie selon l’espèce, les saisons, les conditions abiotiques et la présence de xénobiotiques (Labrot et al., 1996 ; Dellali et al., 2001).

6. 4. Peroxydation lipidique

Une augmentation importante de flux de molécules oxydantes peut entraîner un dépassement des capacités antioxydantes des organismes et générer des dommages au niveau des macromolécules. La mesure de certaines altérations subcellulaires constitue un biomarqueur pertinent qui reflète l’effet de l’exposition à des molécules oxydantes.

Parmi les dommages causés par les espèces réactives de l’oxygène (ERO) au niveau des macromolécules biologiques figure la peroxydation des acides gras polyinsaturés (lipoperoxydation).

La dégradation des lipides se produit principalement au niveau des phospholipides membranaires car leurs chaînes d’acides gras constituent la cible des attaques radicalaires. Les acides gras polyinsaturés sont la cible privilégiée de l’attaque par le radical hydroxyle capable d’arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons pour former un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle.

Cette réaction appelé peroxydation lipidique, forme une réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d’un autre acide gras qui forme un nouveau radical diène conjugué.

La peroxydation lipidique consiste en trois réactions de type radicalaires : initiation, propagation et terminaison (Figure 4) :

*Etape d’initiation : se manifeste par le captage d’un atome d’hydrogène au niveau d’un

groupement allylique CH2 d’un acide gras polyinsaturé par une espèce hautement réactive,

en l’occurrence un radical hydroxyle (●_{OH), alkoxyle (RO}●_{) ou peroxyle (ROO}●_{) pour donner}

un radical alkyle (R●_{). Il s’ensuit un réarrangement moléculaire permettant l’obtention d’un}

diène conjugué. Ce dernier réagit avec une molécule d’oxygène pour former un radical peroxyle très réactif (ROO●_).

*Etape de propagation : le radical peroxyle instable favorise l’attaque successive des

phospholipides voisins donnant naissance à un nouveau alkyle et un hydroperoxyde lipidique (ROOH).

*Etape de terminaison : le processus de peroxydation se poursuit jusqu’à ce que deux

radicaux réagissent entre eux.

Les hydroperoxydes ainsi formés vont se décomposer par clivage de leur chaîne carbonée en un mélange complexe de molécules comprenant des alcanes (pentane et éthane...) et des aldéhydes (malondialdéhyde (MDA), 4-hydroxy-2-nonenal, dienal) (Dotan et

al., 2004 ; Lackner, 1998). Ainsi le MDA forme une expression de la lipoperoxydation

(Pompella et al., 1987 ; Sunderman et al., 1987), cette dernière est le résultat de l'attaque des lipides polyinsaturés par des ERO générées dans certaines conditions de stress, en particulier avec des contaminants organiques (HAPs, PCBs, pesticides) et inorganiques (métaux de transition).

Toutefois, la lipoperoxydation présente aussi une variation en fonction de l’espèce, de l’âge, de la saison, des conditions abiotiques et du tissus étudié (Kappus, 1987 ; Viarengo et

al., 1990), de plus elle peut constituer un phénomène physiologique naturel qui intervient dans la dégradation de nombreux métabolites cellulaires (hormones, acides gras...) (Sani, 2007).

La lipopéroxydation peut être mesurée grâce au dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS), tel que le MDA qui est considéré comme un biomarqueur de stress oxydatif en général, et de peroxydation lipidique en particulier.

Figure 4 : Peroxydation lipidique (Site web 1).

6. 5. Métallothionéines : biomarqueur de stress métallique

Les métallothionéines (Mt) ont été utilisées en tant que biomarqueur d’exposition à des contaminations métalliques, ces protéines sont impliquées dans la régulation des métaux se propageant dans l’organisme (Roesijadi et Robinson, 1994 ; Viarengo et al., 2000). Elles jouent un rôle fondamental dans la régulation des éléments métalliques essentiels (Cu, Zn) et dans la détoxification des métaux lourds toxiques (Cd, Hg).

Diverses études mettent en évidence leur implication dans l’augmentation de la résistance des individus à un stress métallique basée sur des mécanismes physiologiques (court terme) et génétiques (long terme) (Klerks et Levinton, 1989 ; Tanguy et Moraga, 2001 ; Knapen et al., 2004). L’induction des Mt peut laisser en cela présager d’altérations potentiellement importantes à des niveaux supérieurs d’organisation. Cependant, d’autres structures moléculaires sont impliquées dans l’homéostasie métallique intracellulaire et ce n’est que lorsque les capacités de séquestration des Mt sont dépassées qu’un effet toxique

L’induction des Mt est donc difficile à traduire en termes d’effets toxiques et son utilisation restreinte à la bioindication (Handy et al., 2003). Il est possible que les Mt soient impliquées dans des processus autres que l’homéostasie métallique. Chez les mammifères, et de manière moins évidente chez les poissons, ces protéines ont la capacité de piéger les radicaux libres tels que les ERO (Cajaraville et al., 2003).