Biologie moléculaire

2.1. Purification des cellules mononucléées

Les échantillons de sang veineux humain sont prélevés et collectés, après obtention d’un consentement écrit pour chaque donneur. Les échantillons sont recueillis dans des tubes contenant de l’héparine ou de l’EDTA.

Deux principales populations sont constituées : celle des donneurs sains (Banque du sang de l’hôpital Hôtel-Dieu, Paris) et celle des patients atteints d’hémopathie maligne (tumorothèque de l’hôpital de Saint-Antoine, Paris). Les cellules mononucléees de chaque échantillon sont isolées sur gradient de densité (Ficoll). L’isolement sur Ficoll repose sur les densités respectives des cellules et du Ficoll. Après centrifugation, les cellules mononucléées forment un anneau opaque surnageant au-dessus du Ficoll. L’anneau est délicatement prélevé, lavé et centrifugé. Le culot cellulaire est conservé à -80°C.

2.2. Extraction de l’ADN génomique

L’extraction de l’ADN génomique des cellules mononucléées repose sur le principe de filtration sur colonne. Brièvement, les cellules sont lysés dans des conditions dénaturantes à température élevée. La lyse est réalisée en présence de Protéinase K. Ensuite, l’ADN génomique est fixé à la membrane de gel de silice de la colonne. Après un lavage minutieux

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éliminant les inhibiteurs, les sels et les autres contaminants chimiques, l’ADN est élué dans l’eau. Les ADN sont conservés à -20°C.

2.3. Extraction des ARN totaux

L’extraction des ARN totaux des cellules en culture repose sur le même principe de filtration sur colonne utilisée au cours de l’extraction de l’ADN génomique.

Les cellules sont remises en suspension dans un tampon contenant du thiocyanate de guanidinium et du phénol associé à un agent réducteur (β-mercaptoéthanol) permettant à la fois de lyser les cellules, de dissocier les protéines, d’inhiber les nucléases, de dénaturer l’ARN et de le séparer de l’ADN génomique. Après centrifugation, la phase renfermant les ARN (phase supérieure) est récupérée. Les ARN sont isolés par filtration sur colonne de silice. En présence d’alcool, les sels chaotropiques (thyocyanate de guanidinium) attirent les molécules d’eau permettant une réaction d’adsorption des acides nucléiques sur la silice. A la fin de plusieurs étapes de lavage, les ARNs sont élués dans de l’eau et sont conservés à -80°C.

2.4. Reverse transcription (RT)

Le brin complémentaire (ADNc) des ARNs extraits est synthétisé, à partir d’amorces oligo dT, par une ADN polymérase ARN dépendante thermostable isolée d’un virus murin (Mu-MLV).

2.5. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Précédée d’une RT, la réaction de polymérisation en chaine (PCR) est une amplification génique reposant sur des cycles successifs de réplication d'une séquence spécifique d'ADN matrice par une ADN polymérase ADN dépendante thermostable (Taq polymérase). Le couple d’amorces spécifiques du gène à étudier le plus adéquat est sélectionné par le programme Primer 3, à partir de la séquence disponible dans la banque de séquence Genbank au NCBI (National center for biotechnology information ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Une analyse in silico par le logiciel d'alignement de séquence BLASTN (également sur NCBI) permet de vérifier la spécificité des amorces.

2.6. Electrophorèse des produits de PCR sur gel d’agarose

Un gel d’agarose est coulé de sorte à ménager des puits dans lesquels le produit de PCR à analyser sera déposé. Lorsqu’un potentiel électrique est appliqué de part et d’autre du gel, l’ADN – qui est hautement chargé négativement à pH neutre – migrera vers le pôle

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positif. Les molécules d’ADN sont séparées dans le gel en fonction de la taille de l’ADN. Plus l’ADN sera de taille réduite, plus facilement il pourra se glisser dans les mailles du gel : plus vite il migrera. Après la migration, l’ADN est mis en présence d’une substance fluorescente qui s’intercale entre les plateaux de bases. Sous rayonnement ultraviolet (UV), des bandes d’ADN apparaissent. Les bandes d’intérêt sont découpées et l’ADN en est extrait et purifié par filtration sur colonne.

2.7. Réaction de polymérisation en chaîne nichée : Nested-PCR

Des séries d’amorces successives peuvent être utilisées pour améliorer la spécificité et le rendement de la PCR. La PCR nichée est réalisée en deux étapes : la première étape est effectuée avec une série d’amorces. Pour éliminer toute source de contamination biologique, notamment la matrice d’ADNc et la première série d’amorces, les produits de PCR sont séparés sur gel d’agarose et purifiés de leurs bandes, comme décrit précédemment. Une deuxième série d’amorces est ensuite utilisée. Le deuxième couple flanque une région interne du premier produit ADN amplifié. Ainsi, le plus grand fragment produit lors des premiers cycles de la PCR est utilisé comme matrice pour la seconde PCR. Les produits de la deuxième PCR sont analysés sur gel d’agarose. Les bandes d’intérêt sont excisées et l’ADN en est isolé.

2.8. Génotypage d’un Single Nucleotide Polymorphism connu

Les échantillons d’ADN génomique sont envoyés à température ambiante au service de génotypage de Genoscreen (Lille, France).

La détection du SNP d’intérêt repose sur le système KASPar (Kompetitive Allele

Specific PCR genotyping system). Le génotypage est effectué en utilisant trois amorces ; deux

amorces – caractérisant chacune un des deux allèles spécifiques – et une troisième amorce pour l’allèle commun. L’amplification spécifique de chaque allèle est alors couplée à une émission de fluorescence particulière. L’acquisition des données du génotypage se fait par la détection de cette fluorescence au niveau du SNP ciblé.

2.9. Séquençage des produits de PCR

Les produits de PCR purifiés à partir des bandes de gel d’agarose (comme décrit précédemment) sont séquencés par Eurofins Genomics en Allemagne.

La portion à séquencer est amplifiée par l’ADN polymérase HotStar-Taq Plus, en utilisant les amorces utilisées pour la deuxième étape de la PCR nichée. Le séquençage est réalisé selon la méthode de Fréderick Sanger, consistant à utiliser, en plus des

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désoxyribonucléotides naturels (dNTP), des didésoxyribonucléotides couplés à des fluorochromes (ddNTP). Ces ddNTPs sont incorporés d’une manière aléatoire au cours de l’amplification, mais dès qu’elle est faite au niveau du nouveau brin, la synthèse s’arrête puisqu’aucune liaison phosphodiester (3’ – 5’) ne peut se créer après une base ddNTP. Les deux brins d’ADN sont séquencés par un analyseur automatisé basé sur un système d’électrophorèse en capillaire, permettant de distinguer deux intermédiaires consécutifs ayant une différence de taille d’un seul nucléotide. Chaque base ddNTP étant marquée avec un fluorochrome différent caractérisé par un signal donné. Le séquençage est effectué base par base et les séquences obtenues sont alignées avec les séquences de référence de la banque Genbank sur NCBI.

2.10. PCR en temps réel

La PCR en temps réel ou PCR quantitative consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle grâce à un marqueur fluorescent et par conséquent, de mesurer quantitativement l’expression des gènes. La PCR quantitative utilise l’ADNc, synthétisé au cours de la réverse transcription, comme matrice. Les fragments amplifiés, en phase exponentielle, sont mis en évidence au fur et à mesure des cycles de la réaction. Les sondes utilisées sont des sondes TaqMan. Une sonde TaqMan est composée d’une séquence spécifique à la séquence cible et fixée à deux fluorochromes, un quencher et un reporter. Le

reporter ne peut émettre un signal que lorsqu’il est libéré au cours de la synthèse du brin

d’ADN. Le quencher est inactivée par l’action de la Taq polymérase. L’émission d’un signal par le reporter permet de suivre à temps réel l’amplification.

La PCR est réalisée en triplicata er les données sont ensuite analysées et normalisées par rapport à un contrôle interne. L’analyse statistique se base sur la méthode du delta Ct (Cycle seuil ou Threshold Cycle). Un contrôle de la qualité et de l’intégrité des ADNc est utilisé pour la PCR classique, la PCR nichée et la PCR en temps réel. Ce contrôle positif cible le gène de référence codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).