Biologie moléculaire 1. Stratégie de clonage

II.2.1.1.1. Réaction de polymérisation en chaine (PCR)

Les PCR sont réalisées dans un volume final de 50 µL. Le mélange réactionnel contient la matrice (50-100 ng), les amorces (0,5 µM), les dNTPs (200 µM) et la polymérase (Taq ou Phusion, New England Biolabs).

Tableau 5 : Programmes d’amplification de l’ADN par PCR. Lorsqu’il y a deux informations dans la case, la

première concerne la polymérase Phusion et la deuxième concerne la polymérase Taq (souligné).

Etape Température Durée

1- Dénaturation 98°C 1 minute

2- Amplification (30 cycles)

98°C 10 secondes / 60 secondes

45-65°C 30 secondes / 60 secondes

72°C / 68°C 20 secondes par kb / 60 secondes par kb

3- Extension finale 72°C / 68°C 10 minutes

La température d’hybridation est ajustée en fonction du Tm des amorces utilisées. La durée d’élongation est définie en fonction de la taille du fragment à amplifier et de la polymérase choisie. Les programmes de PCR utilisés sont compilés dans le Tableau 5.

56 II.2.1.1.2. Purification des produits de PCR

Les produits de PCR sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose 0,8 % dans du tampon TAE 1X (TAE 20X : 0,8 M Tris-HCl pH 8,5, 0,45 M acide acétique et 0,5 M EDTA, ajusté à pH 8,5). Les fragments sont séparés en fonction de leur masse moléculaire puis colorés au bromure d’éthidium (BET). Les fragments sont découpés sur gel puis purifiés avec le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel).

II.2.1.1.3. Clonage

Le plasmide destiné à recevoir l’insert est linéarisé par digestion enzymatique et purifié sur gel d’agarose. Le vecteur et l’insert purifiés sont assemblés par ligation pendant la nuit à 16°C en présence de la T4 DNA ligase suivant les instructions du fournisseur (New England Biolabs). Les stratégies de clonage sont décrites dans la section II.2.1.2.

II.2.1.1.4. Transformation d’E. coli et criblage des transformants

Les réactions de ligation (10 à 20 µL) sont transformées dans 100 µL de bactéries chimio-compétentes DH5α (section II.2.2.2.1). Les colonies obtenues sont prélevées et ensemencées dans du milieu sélectif (milieu riche LB supplémenté avec les antibiotiques adéquats) et incubées à 37°C pendant la nuit. L’ADN plasmidique est extrait et purifié en utilisant le kit d’extraction NucleoSpin® Plasmid (Macherey Nagel). Le plasmide purifié est séquencé pour vérifier la construction obtenue. Les souches sélectionnées sont congelées à -80°C dans du milieu LB supplémenté avec 20 % de glycérol.

II.2.1.2. Constructions des souches

Figure 31 : Localisation dans le chromosome de B. subtilis des gènes codant des fusions avec des protéines rapportrices fluorescentes. La stratégie générale utilisée pour les constructions et leur insertion dans les loci du

chromosome bactérien sont schématisées. Le gène codant pour la protéine fluorescente mCherry est fusionné au gène lacI pour la localisation de l’ADN des phages dérivés de SPP1delX110lacO64, le gène codant pour la protéine fluorescente mCitrine aux gènes de SPP1 et le gène codant pour la protéine fluorescente mCFP aux gènes de la bactérie. Lorsque des variations de cette stratégie ont été utilisées, elles sont décrites ci-dessous.

57 II.2.1.2.1. Fusion lacI-mcherry, rapportrice de l’ADN viral, insérée dans le locus thrC Le gène mcherry (dont la séquence a été optimisée pour son utilisation dans B. subtilis) est amplifié par PCR à partir du vecteur pJ1 (reçu d’A.O. Henriques) avec les amorces 1 et 2. Le produit de PCR obtenu est digéré par les enzymes de restriction XhoI et BamHI et cloné dans le vecteur pHP13 digéré avec les mêmes enzymes. Le plasmide obtenu, pAL1, est ensuite digéré par les enzymes de restriction EcoRI et BamHI et inséré dans le plasmide pKL190 digéré avec les mêmes enzymes pour donner le vecteur pPT300. Ce plasmide est linéarisé par digestion avec l’enzyme XbaI et utilisé pour transformer la souche YB886. La fusion LacI-mCherry, insérée dans le locus thrC, permet l’obtention de la souche GSY10004.

II.2.1.2.2. Fusions de gènes de SPP1 au gène mcitrine et insertion dans le locus sacA Le vecteur pSacKan (obtenu du Bacillus Gene Stock Center) est modifié pour fusionner les gènes codant pour les protéines du phage (gp11, gp12, gp34.1, gp40 et gp39-gp40) au gène de la protéine fluorescente mCitrine dont la séquence a été optimisée pour son utilisation dans B. subtilis (pJexpress-DNA2.0). Le promoteur Pspac est amplifié à partir du vecteur pDH88, digéré avec les enzymes de restrictions BamHI et XbaI et inséré dans le vecteur pSacKan digéré avec les enzymes de restriction Bglll et XbaI pour obtenir le vecteur pAL19. Pour les fusions des protéines de SPP1 au N-terminus de la mCitrine (protéine phage-mCitrine), le gène mcitrine est amplifié à partir du vecteur pJexpress avec les amorces 3 et 4 et inséré dans le pAL19 après digestion avec les enzymes de restriction EcoRI et BamHI. On obtient le vecteur pAL21. Pour les fusions des protéines de SPP1 au C-terminus de la mCitrine (mCitrine-protéine phage), pJexpress est digéré avec les enzymes BamHI et EcoRI pour extraire le gène

mcitrine et inséré dans le pAL19 digéré avec les mêmes enzymes de restrictions. On obtient le vecteur

pAL20.

Les gènes 12, 34.1, 40 et 39,40 de SPP1 sont respectivement amplifiés avec les amorces 5/6, 7/8, 9/10 et 11/12 et insérés dans le pAL21 après digestion avec les enzymes ClaI et XhoI.

Le gène 11 de SPP1 est amplifié avec les amorces 13 et 14 et inséré dans le vecteur pAL20 entre les sites de restriction ClaI et BamHI.

Les 5 plasmides obtenus avec les gènes de SPP1 sont linéarisés avec l’enzyme ScaI et utilisés pour transformer la souche GSY10004.

II.2.1.2.3. Fusions de gènes de l’hôte au gène mcfp et insertion dans le locus amyE

Le vecteur pSG1190 est modifié pour exprimer des fusions de la protéine fluorescente mCFP en

N-terminus de protéines de l’hôte. La séquence de mcfp a été optimisée pour son utilisation dans

58 avec les amorces 15 et 16 et inséré dans le vecteur pDG1190 entre les sites de restrictions BamHI et KpnI pour remplacer le gène cfp non-optimisé. On obtient le vecteur pAL28. Les gènes dnaG et dnaX de B. subtilis sont respectivement amplifiés avec les amorces 17/18 et 19/20. Les produits de PCR sont ensuite respectivement digérés avec les enzymes BamHI/ClaI et BamHI/XhoI puis insérés dans le pAL28 lui-même digéré par les mêmes enzymes. Les plasmides obtenus avec les gènes de l’hôte (pAL31 et pAL36) sont linéarisés avec l’enzyme SacI et utilisés pour transformer la souche GSY10004.

II.2.1.2.4. Fusion du gène 12 de SPP1 au gène mcfp et insertion dans le locus amyE

Le vecteur pSG1192 est modifié pour exprimer la fusion de la protéine fluorescente mCFP en

C-terminus de la protéine gp12 du phage. La séquence de mcfp a été optimisée pour son utilisation dans B. subtilis (reçue de T. Doan et de D. Rudner). Le gène mcfp est amplifié à partir du vecteur pDR200 avec les amorces 21 et 22 et inséré dans le vecteur pDG1192 entre les sites de restrictions EcoRI et SpeI pour remplacer le gène cfp non-optimisé. On obtient le vecteur pAL29. Le gène 12 de SPP1 est amplifié avec les amorces 23 et 24. Le produit de PCR est ensuite digéré avec les enzymes KpnI et XhoI puis inséré dans le pAL29 lui-même digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide obtenu avec le gène

12 de SPP1 (pAL44) est linéarisé avec l’enzyme SacI et utilisé pour transformer la souche GSY10025.

II.2.1.2.5. Fusions de gènes de l’hôte au gène gfp et insertion dans le locus amyE

L’ADN chromosomique des souches exprimant les fusions polC-gfp, dnaX-gfp, gfp-dnaN, gfp-ssbA,

gfp-dnaB, dnaE-gfp et gfp-dnaC (Meile et al, 2006) est purifié et transformé dans la souche GSY10004.

II.2.1.2.6. Système minimal de réplication in vivo

Figure 32 : Schéma du système minimal de réplication de SPP1 en utilisant un système de trans-complémentation dans B. subtilis (souche GSY10092). Les gènes codant pour les protéines gp39 et

gp40-mCitrine ont été insérés dans le chromosome bactérien sous le contrôle du promoteur Pspac. Les gènes codant pour les protéines gp37.3 et gp38 ont été clonés dans un plasmide incapable de se répliquer dans B. subtilis générant le plasmide pAL47. Gp38 en complexe avec les protéines gp39 et gp40 va se lier à oriL, localisé sur son propre gène, pour initier la réplication. 64 motifs répétés lacO sont également présents sur le plasmide pour le visualiser dans la bactérie avec la protéine LacI-mCherry.

59 Le vecteur pJW101 (Wang et al, 2004) est utilisé comme matrice pour amplifier l’origine de réplication de pUC9 dans E. coli et la cassette de résistance au chloramphénicol du plasmide pHP13 avec les amorces 25 et 26. Le fragment obtenu est digéré par l’enzyme de restriction KpnI puis une ligation est faite pour que le fragment se recircularise générant le vecteur pAL40, amplifié dans E. coli. Un fragment contenant les gènes 37.3 et 38 est amplifié avec les amorces 27 et 28 et inséré dans le pAL40 entre les sites de restriction XbaI et KpnI. Le plasmide résultant, pAL47, est transformé dans B. subtilis GSY10079 qui exprime les gènes 39 et 40-mcitrine sous le contrôle du promoteur Pspac générant GSY10092 (Figure 32).