Biofonctionnalisation de QDs DHLA et PEG-DHLA

Ces deux protocoles ont mené à des QDs bien dispersés en milieu aqueux. Il faut cependant conserver les échantillons à 4 °C à une concentration de l’ordre du μM pour éviter que les QDs ne précipitent.

Pour vérifier l’efficacité de la conjugaison de la SAV sur les QDs-DHLA, nous avons effectué des tests en incubant les différents échantillons avec des microbilles enrobées de biotine. Malheureusement, l’expérience contrôle avec des QDs-DHLA sans SAV a démontré que ces QDs collaient sur les microbilles, ce qui nous a empêché d’utiliser ce test comme diagnostique. Nous avons aussi tenté de valider la conjugaison des QDs-PEG- DHLA avec la SAV en faisant migrer les échantillons, par électrophorèse, dans un gel d'agarose. Le résultat de cette expérience est présenté à la figure 27.

Lorsque nous avons fait les tests sur cellules, les QDs-DHLA-SAV adhéraient un peu partout (cellules Hek et neurones), et nous avons même observé plusieurs agrégats de multiples QDs. Nous avons aussi remarqué des problèmes de spécificité pour les QDs- PEG-DHLA (tests sur neurones seulement).

Par rapport aux QDs-DHLA, l’ajout de PEG a amélioré la qualité de l’échantillon pour les QDs-PEG-DHLA. Nous avons observé moins d’agrégats après le marquage sur cellules. De plus, l’arrosage de QDs-PEG-DHLA avec la micropipette donnait lieu à un nuage de QDs qui diffusaient normalement dans la solution d’imagerie. Pour les QDs-DHLA, lorsque nous avons appliqué une pression pour faire sortir les QDs de la micropipette, il y a eu éjection d’agrégats et de particules qui, au lieu de diffuser dans la solution, semblaient conserver leur vitesse et leur direction initiales (trajectoires balistiques), et qui ont adhéré directement sur les cellules.

Le tableau 2 présente les différents ratios de produits et réactifs utilisés pour la conjugaison de la SAV sur les QDs-DHLA. Alors que les échantillons 1-2 et 3 ont été concentrés avant d’être dilués dans un volume final de 50 uL de tampon, les échantillons 4-5-6 ont été dilués dans un total de 500 μL de tampon après leur concentration. À la figure 26, je présente une photo de ces 6 échantillons après 2 ans d’entreposage à 4 °C. Nous remarquons que les échantillons 1-2-3 sont toujours bien dispersés dans le tampon, alors que les échantillons 4- 5-6 se sont agrégés dans le fond du tube conique.

Tableau 2: Tableau des réactifs pour la conjugaison de la streptavidine avec les QDs- DHLA

# Échantillon Volume QDs (30 μM) Volume SAV (1mg/mL) (18 μM) Volume EDC (10mg/mL) (66 mM) [μL] [μL] [μL] 1 20 1 5 2 20 2 5 3 20 5 5 4 20 2 10 5 20 5 10 6 20 10 10

Figure 26: Agrégation d’échantillons de QDs-DHLA conjugués à la streptavidine

Échantillons de QDS-DHLA-SAV conservés pendant deux ans à 4°C. Les quantités de réactifs utilisées pour chaque échantillon sont présentées au tableau 2. 1, 2 et 3 : Lorsque la concentration des QDs est suffisamment élevée, ces derniers conservent bien leur couche de ligands de surface et restent en suspension colloïdale en milieu aqueux. 4, 5 et 6 : en diluant dans un volume de tampon 10 fois plus élevé (les quantités nettes de QDs sont aussi inférieures, car il y a eu plus de pertes durant les purifications), les échantillons précipitent, ce qui peut être dû par la perte progressive des ligands dans le tampon.

Nous pouvons expliquer cela par le fait qu’une partie des ligands échangent constamment entre la surface des QDs et le tampon. Lorsqu’il y a trop de tampon par rapport aux QDs dans l’échantillon, le DHLA décroche plus vite de la surface des QDs qu’il ne s’y raccroche, ce qui mène à une perte de ligands à la surface des QDs. Je suggèrerais donc de conserver les QDs en suspension dans un milieu aqueux à une concentration minimale de 1 μM.

Lors de la conjugaison des QDs avec la SAV en utilisant de l’EDC, nous avons noté quelques anomalies. Premièrement, pour les QDs-DHLA, le passage de la solution dans le filtre seringue après la conjugaison était pénible et requérait l’application d’une forte pression sur la seringue. Cela était encore plus vrai pour les échantillons où la quantité d’EDC utilisée était plus importante. De plus, pour les échantillons associés à l’utilisation des plus grandes quantités de SAV et d’EDC (échantillons 5-6), nous n’avons pas été capable de concentrer la solution au minimum du volume de concentration (10-20 μl) du filtre vivaspin, et beaucoup de QDs collaient à la membrane du filtre.

Le fait que l’on retrouve quatre amines primaires et quatre carboxyles terminaux sur chaque SAV fait en sorte que cette protéine a 8 sites pour former un lien amide avec un QD ou une autre SAV. Ainsi, il est fort probable que le mélange instantané de l’EDC avec les QDs et la SAV mène à la formation de gros complexes de QDs liés les uns aux autres par des ponts formés de SAV.

Les résultats associés à la conjugaison des QDs-PEG-DHLA avec la SAV en utilisant de l’EDC vont dans le même sens. Lorsque nous avons voulu faire migrer les QDs dans le gel d’agarose, les QDs-PEG-DHLA non conjugués pénétraient le gel, alors qu’une minorité des QDs conjugués le pénétrait (figure 27). Étant donné que les plus petites particules migrent plus facilement dans le gel que les plus grosses, il est fort probable que ce soit la formation d’agrégats de QDs, lors de la conjugaison, qui explique ce résultat. Il est aussi possible que la réaction avec l’EDC ait endommagé l’enrobage des QDs, et que la diminution de la charge négative des QDs due à la perte de PEG-DHLA se soit traduite par des problèmes de migration des QDs. Le tableau 3 présente les quantités de réactifs utilisées pour la préparation des échantillons.

Tableau 3: Tableau des réactifs pour la conjugaison de la streptavidine avec les QDs PEG-DHLA

# Échantillon Volume QDs Volume SAV

(1mg/mL) (18 μM) Volume et concentration d’EDC [μL] [μL] - A 1 - - B 1 2.5 1 μL à 2 mM C 1 5.0 1 μl à 2 mM D 1 10 1 μL à 40 mM E 1 2.5 1 μL à 40 mM F 1 5.0 1 μL à 40 mM G 1 10 1 μL à 40mM

Figure 27: Migration des QDs PEG-DHLA conjugués à la SAV en utilisant de l’EDC

Les lettres des colonnes de migration réfèrent au tableau 3, où les quantités de réactifs utilisées pour chaque échantillon sont présentées. L’échantillon A est un contrôle, où les QDs n’ont pas été couplés à la SAV. Alors que pour cet échantillon, tous les QDs pénètrent le gel sans problème, la majorité des QDs des échantillons ayant subi la conjugaison restent piégés dans les premiers millimètres du gel.