Biodégradation par voie aérobie en milieu liquide

IV.2.1. Mesure de la demande biologique en oxygène (DBO)

La Demande Biologique en Oxygène (DBO) mesure la quantité d’oxygène nécessaire pour la dégradation d’un matériau par des microorganismes dans des respiromètres fermés (Oxitop OC^R 100). Elle nécessite que le matériau soit la seule source de carbone dans un milieu d’essai. La mesure de DBO a été réalisée conformément à la norme ISO 14851.

a. Milieu d’essai

Le milieu d’essai est composé de 10 mL de la solution A (KH2PO4 8,5 g.L^-1,K2HPO4

21,75 g.L^-1, NH4Cl 0,5 g.L^-1, Na2HPO4 33,4 g.L^-1) et de 1 mL des solutions B (MgSO4 22,5 g.L^-1), C (CaCl2, 2H2O 6,1 g.L^-1) et D (FeCl3 0,25 g.L^-1) pour 1 litre de milieu d’essai.

b. Inoculum

L’inoculum utilisé pour cette méthode est constitué d’une boue activée récupérée à la station d’épuration de la ville de Bourg en Bresse. Cette boue est caractérisée par sa matière sèche qui est déterminée après séchage à 105 °C pendant une nuit. La qualité microbiologique de la boue est déterminée par dénombrement sur milieu gélosé PCA pour les bactéries (après incubation à 30 °C pendant 24 heures) et sur milieu Sabouraud pour les moisissures (après incubation à température ambiante pendant 48 heures).

c. La mise en œuvre du test

Dans chaque respiromètre de 500 mL, une quantité de 0,1 g de boue activée a été ajoutée en tant qu’inoculum. Une masse de 55 mg de matériau (broyé puis tamisé à 0,2 mm) a été introduite dans un volume final de 164 mL de milieu d’essai sauf pour le témoin (pour évaluer la respiration endogène des microorganismes). Durant toute la période d’essai, les

respiromètres ont été placés sous agitation à 23 °C. Une aération d’environ 10 minutes des respiromètres a été réalisée pour introduire de l’oxygène dans les milieux d’essais.

Figure 38 : Différents éléments d’un respiromètre fermé *MV : matière volatile

*MS : matière sèche

IV.2.2. Isolement et identification des souches dégradant les matériaux à base de farine de maïs par la méthode des zones claires

a. Mise en culture

Après 30 minutes de décantation de la boue (récupérée à la station d’épuration de Bourg en Bresse), 100 µL de surnageant ont été étalés à la surface d’un milieu minéral gélosé mélangé avec du matériau broyé et tamisé à 0,2 mm. Les milieux ont ensuite été incubés à 45°C jusqu’à apparition de zones claires (halos) autour des colonies. Pour réaliser un témoin positif, une souche de Bacillus licheniformis (ATCC 27811) productrice d’5-amylase a été utilisée dans les mêmes conditions.

b. Milieu minéral gélosé

Le témoin positif est réalisé sur une gélose à l’amidon et les essais sur un milieu de base dépourvu d’éléments carbonés, additionné du matériau (92% de farine de maïs et 8% de glycérol) broyé et tamisé à 0,2 mm. La composition du milieu de culture est la suivante (pour

2L) : KH₂PO₄ : 4,6 g ; NaH₂PO₄ : 11,6 g ; NH₄Cl : 2 g ; MgSO₄ : 1 g ; FeCl₃ : 0,2 g ; CaCl₂ : 0,01 g ; 30 g d’agar ; 2 L d'eau distillée.

c. Révélation des zones claires

Après incubation, le milieu gélosé est inondé avec du lugol afin de révéler les zones où le matériau est complètement hydrolysé par la souche. Le témoin positif de ce test a été réalisé sur une gélose à l’amidon

d. Identification des souches sélectionnées

Les colonies entourées d’un halo clair sont mises en culture dans un milieu non sélectif PCA (une colonie par boite). Après incubation à 30°C pendant 24 heures, des colorations de Gram et des tests catalase et oxydase ont été effectués. Les colonies ont ensuite été mises en culture à 30°C pendant 24 heures dans deux milieux sélectifs . L’identification de la souche à été réalisée à l’aide d’une galerie API 50CHB.

IV.3. Compostage

IV.3.1. Caractérisation du compost par dénombrement de la flore totale et mesure du pH

La qualité biologique du compost a été évaluée grâce à un dénombrement des bactéries et des champignons respectivement sur PCA et Sabouraud au début et à la fin du test. Des mesures de pH, selon un rapport substrat/eau de 1/5 (m/m), ont été effectuées au début et la fin du test pour évaluer s’il y a eu une acidification du milieu.

IV.3.2. Evaluation de la biodégradation par mesure de la perte de poids (désintégration) Selon la norme ISO/DIS 16929, un matériau plastique est dit biodégradable si, au bout de 12 semaines (84 jours) d’enfouissement dans du compost, le pourcentage de désintégration dépasse 90%. Pour étudier la biodégradation du matériau, une série d'échantillons (d’aire spécifique 0,65 mm^-1, dimensions de l’éprouvette : 45mm x 18mm x 4mm) ont été enfouis dans du compost (récupéré à la déchetterie de la Tienne, Viriat, France). Ce dernier a étéplacé dans une enceinte thermostatée à 40°C et à 90 % d'humidité relative. Des retournements des déchets biologiques ont été effectués chaque semaine afin d’éliminer les agglomérats et d’assurer une meilleure circulation de l’air et de l’eau dans le compost. Des mesures de perte de poids des échantillons secs ont été effectuées tous les 15 jours.

IV.3.3. Observation de la morphologie des échantillons par microscopie électronique à balayage environnementale.

La dégradation et la colonisation de la surface du matériau ont été observées avec un microscope électronique à balayage environnemental (MEBE) Jeol 840A LGS (Jeol ltd, Tokyo, Japon) réalisées au CTµ (Centre Technologique des Microstructures, Université Lyon1). Ceci a permis d’observer l’évolution de la colonisation des échantillons et la dégradation du matériau au cours de l’enfouissement. Pour les observations, les échantillons ont été nettoyés à l’aide d’une brosse sans aucun autre traitement préalable.

IV.3.4. Evaluation de la biodégradation par mesure du dioxyde de carbone libéré

a. L’inoculum

L’inoculum utilisé dans cette étude était un compost de déchets verts âgé de 3 mois. Ce dernier a été broyé et tamisé à l’aide d’un tamis ayant un diamètre de pores de 1 cm pour assurer une bonne circulation de l’air. Six grammes du matériau broyé et tamisé à 0,2 mm ont été mélangés avec 36 g de compost (selon un rapport massique de 1/6 (m/m) (ISO 14855)) d’une humidité relative d’environ 50 % ajustée en ajoutant de l’eau. Le mélange compost - matériau a été introduit dans des jarres (figure 39) d’un litre contenant un bécher rempli avec 40 mL de NaOH (1 mol.L^-1). Les jarres ont ensuite été fermées à l’aide des têtes Oxitop et incubées dans une étuve à 35°C. Les jarres ont été ouvertes périodiquement (environ tous les trois jours) pour renouveler la solution de soude et introduire de l’oxygène.

Figure 39 : Les jarres contenant du compost mélangé avec le matériau (LGCIE, EA n^o 4126, INSA Lyon-Université Lyon1).

b. Mesure de la production de dioxyde de carbone par piégeage chimique

La mesure de la quantité de dioxyde de carbone produit pendant la respiration des microorganismes en utilisant le matériau comme seule source de carbone est la technique la plus utilisée dans les tests respirométriques (Kale et al., 2007). Le dioxyde de carbone issu de la biodégradation du polymère a été utilisé pour le calcul du pourcentage de minéralisation. Pour cette méthode, l'inoculum microbien utilisé produit naturellement du dioxyde de carbone pendant la respiration endogène, cette valeur doit donc être retranchée. Elle a été déterminée en réalisant un témoin sans polymère.

Le CO2 a été piégé dans une solution alcaline de soude (1 mol.L^-1) en large excès de concentration connue selon la formule suivante :

O

H

CO

Na

NaOH

2

CO

→

Le dosage acido-basique de la solution permet de quantifier la soude n'ayant pas réagi avec l'HCl (1 mol.L^-1). Par conséquent, la quantité totale de CO2 dégagée déduite a permis de calculer le pourcentage de biodégradation selon la formule suivante :

- CO_{2 T} : Quantité de CO₂ mesurée dans le flacon contenant le matériau ; - CO_2B : Quantité de CO₂ mesurée dans le flacon témoin sans lematériau ;

- ThCO₂ : Quantité théorique de CO₂ susceptible d’être produite par oxydation totale du matériau calculée selon la formule suivante :

12 44 C M

ThCO2==== tot×××× tot××××

- M_tot : Masse (g) de matière sèche totale du matériau introduit dans les récipients de compostage ;

- Ctot : Teneur relative en carbone organique par rapport à la matière sèche totale contenue dans le matériau (g / g) ;

44 et 12 sont respectivement les masses moléculaires et atomiques relatives du dioxyde de carbone et du carbone.

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