Biocompatibilité - Cytocompatibilité (LDH et MTT)

La cytocompatibilité des 7 lots synthétisés préalablement et des trois lots sélectionnés par la suite est testée par deux test : le test MTT et le test LDH. Les variables expérimentales définies étant :

¾ La concentration en nanoparticules variant de façon croissante soit 50, 75 et 100 µg de nanoparticules sèches par ml de milieu complet DMEM sans rouge de phénol.

¾ Le temps de contact entre les nanoparticules et les cellules en monocouche variant de 24, 48 et 72h dans un incubateur à 37°C.

¾ Les types cellulaires du cartilage (chondrocytes ou synoviocytes) et la morphologie même des nanoparticules (7 lots différents spécifiés plus haut).

Lors de l’étude en monocouche, ces test de cytocompatibilité sont effectués directement sur des cellules cultivés en plaques 96 puits sur lesquelles on dépose les différents concentrations en nanoparticules.

Pour l’étude en bille d’alginate, un temps de contact de 24h entre cellules et nanoparticules en monocouche est préalablement effectué. Puis le tout est incorporé dans la solution alginique et mise en bille par réticulation calcique.

Les résultats sont donnés sous forme d’histogramme où la viabilité de chaque échantillon est rapportée par rapport aux cellules témoins. Ces cellules témoins représente la valeur 100% de notre étude car cultivées dans du milieu DMEM sans nanoparticules.

I.1.3.1. Test MTT

Le test MTT (bromure de 3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tétrazolium) est une méthode colorimétrique utilisée pour évaluer la viabilité cellulaire. Ce test repose sur la réduction du MTT par la succinate déshydrogénase mitochondriale conduisant à la formation de cristaux bleus de formazan. La diminution de cette activité est directement liée à l’apparition d’une toxicité.

Le test MTT se déroule identiquement que les cellules soient en bille ou en monocouche. Pour l’étude en monocouche, les cellules sont directement cultivées en plaques 96 puits alors que pour l’étude tridimensionnelle, les billes avec et sans cellules sont déposées en plaque 96 puits à raison d’une bille par puits.

La suite est commune aux deux études, les cellules en monocouche ou les cellules en billes sont cultivées avec 100 µL de milieu de culture supplémentés de 25 µL de MTT (5 mg/mL

dans du PBS 1x) à 37°C sous 5% de CO2 durant 4 heures avant de remplacer ce milieu par 100 µL de tampon de lyse SDS/DMF (80 g de SDS, 200 ml de DMF (diméthylformamide), 200 mL d’eau distillée, pH 4.7 avec HCl 1 N). La densité optique (DO) est déterminée sur un spectrophotomètre Thermo Labsystems Multiskan EX à 580 nm, 24 heures après l’ajout du mélange SDS-DMF (temps de solubilisation des cristaux de formazan).

I.1.3.2. Test LDH :

Principe : Mesure de l’activité dépendante de la lactate déshydrogénase :

La mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) présente dans le surnageant de culture est réalisée à l’aide d’un kit (« cytotoxicity detection kit », Roche).

La méthode est basée sur la réduction du NAD en NADH,H+, suite à la transformation par la LDH du lactate en pyruvate. La diaphorase transfert alors le H+ du NADH sur le sel de tetrazolium (chlorure de 2-[4-iodophényl]-5-phényltétrazolium) qui sera réduit en sel de formazan. L’augmentation de l’activité LDH est directement corrélée avec la formation de formazan. Ainsi, la coloration rouge qui se forme est proportionnelle au nombre de cellules dont la membrane cytoplasmique est altérée.

Le surnageant de culture (100 µl) est mélangé avec 100 µl d’une solution contenant du NAD+, du sel de tétrazolium et du lactate de sodium. L’ensemble est incubé 10 min à l’obscurité. La réaction est ensuite arrêtée par 50 µl de chlorure d’hydrogène (1N) et l’absorbance est lue à 490 nm (lecteur de plaques MR 5000 Dynatech, Guyancourt, France).

I.1.3.3. Biosynthèse des protéoglycanes par incorporation de

35

S :

Cette technique permet d’évaluer la synthèse de protéoglycanes (PGs) par mesure de l’incorporation de soufre radioactif (³⁵Na₂SO₄^2-) (Perkin Elmer) durant leur biosynthèse dans les cellules. Pendant 4 h, les billes sont placées dans des plaques 24 puits, avec du milieu de culture contenant 10 µCi/ml de ³⁵Sà 37°C. Les billes sont lavées 5 fois dans 2 ml de NaCl 0,9

comptage de chaque échantillon de 5 billes a lieu sur un analyseur de scintillation liquide (Tri-Carb 2100 TR, Packard).

I.1.3.4. Dosage du DNA

Le Hoechst (Hoechst 33258, Molecular Probes) est un agent fluorescent intercalant de l’ADN. Sa quantification permet de nous informer sur le nombre de cellules contenues dans chaque bille et donc de la prolifération cellulaire au sein des biomatériaux. Le réactif de Hoechst est

solubilisé à 0,1 µg/ml dans un tampon tris 10 mM-1 nM EDTA - 0,1 M de NaCl à pH 7.4.

Une gamme étalon de 0 à 0,5 µg/ml est établie à partir d’ADN de thymus de veau (Sigma). Les culots cellulaires, obtenus à partir de 3 billes, sont repris dans 100 µl de tampon. Les échantillons sont placés trois fois dans de l’azote liquide puis dans un bain-marie à 37 °C. Deux millilitres de solution de Hoechst sont ajoutés à chaque échantillon. Le dosage est effectué à une longueur d’onde d’excitation de 356 nm et une longueur d’onde d’émission de 458 nm sur un spectrofluorimètre (Hitachi F-2000, France). Le nombre de cellules est calculé à partir de la quantité d’ADN dosé en utilisant la correspondance suivante : 7,8 pg ADN/chondrocyte.

I.1.3.5. Immunofluorescence

Les cellules sont cultivées sur lamelles de verre 12 mm, à une densité de 50 000 cellules par puits dans du milieu complet pendant 24-48 heures. Puis les cellules sont incubées avec les nanoparticules contenant du Dextran-FITC (100 µg/ml) pendant 6h, 12h et 24 heures. Ensuite, les cellules sont fixées avec une solution de PAF 4% pendant 15 min à température ambiante. Lors des expériences de compétition avec le récepteur de l’acide hyaluronique (CD44), les cellules sont au préalable incubées avec une solution d’anticorps (5 µg/ml) pendant 2 heures puis incubées avec les différents lots de nanoparticules (50 µg/ml). Pour terminer, le protocole décrit précédemment pour l’immuno-localisation des nanoparticules contenant du FITC est utilisé.

I.1.3.6. Microscopie confocale

Les images en microscopie confocale et les spectres d’émission ont été réalisés à l’aide d’un microscope confocale à balayage laser SP2, dépourvu de filtre (Leica microsystèmes, France), équipé de lasers argon (raies 457 nm, 476 nm, 488 nm, 514 nm) et Hélium-Néon (543 nm et 633 nm) et d’un objectif à immersion huile corrigé x63 (HCX PL

APO CS 63.0 x 1.32, code 506180 Leica). Le signal d’émission de fluorescence est recueilli de manière optimisée, pour chaque canal, après décomposition de la lumière de fluorescence sur un prisme (AOBS - Acoustical Optical Beam Splitter), et sélection d’une bande passante spécifique (FITC XX nm).