Certaines bactéries ou groupes bactériens, mis en évidence par des tests spécifiques, peuvent être considérés comme témoins de contamination, d’origine humaine et indiquer la présence possible des bactéries pathogènes (Sutra et al, 1998).
Le dénombrement de certaines flores, permet d’apprécier de façon plus globale la qualité microbiologique d’un aliment. (Ex : la flore mésophile à 30°C).Ce dénombrement ne doit pas être interprété comme une indication de la salubrité des produits.
D’autres flores peuvent être intéressantes à dénombrer la mesure ou elles fournissent une indication sur la présence et le nombre des micro-organismes, dotés de fortes activités
Métaboliques :(Ex flore psychotrope, flore thermophile, dénombrement des levures et moisissures) (Sutra et al. 1998).
12 II -6-Toxi-infections alimentaires :
Une toxi-infection alimentaire est définie comme étant un ensemble de dysfonctionnements de l’organisme résultant de l’ingestion d’un aliment contaminé par des microorganismes pathogènes (Bonnefoy et al. 2002).
Le Tableau(4) montre les micro-organismes responsables de la toxi-infection alimentaire, des symptômes des maladies qu’ils engendrent ainsi que les principaux produits alimentaires dans lesquels on peut les rencontrer.
Tableau 4: Origines des toxi-infections alimentaires
Micro-organismes
Période d’incubation
Symptômes Aliments les plus touchent
Précautions à prendre Salmonella 12 à 24 heures Nausées, fièvre,
diarrhées, douleurs
1à6 heures Forts vomissements, diarrhées, crampes
12 à 36 heures Nausées, diarrhées, vomissement, maux de
2 à 4 jours Colites hémorragiques, urémies II -6-1-Causes des toxi-infections :
Les contaminations microbiologiques représentent des risques majeures sur le plan sanitaire et leur évaluation est très difficiles, la majorité des cas de toxi-infections alimentaires sont dû à
13 des aliments prépares à la maison, à la restauration, dans les cantines scolaires, les hôpitaux, les maisons de retraites et 5 à 10% des cas à des denrées alimentaires produits par l’industrie (Moll et Moll, 2000).
Les principales causes de toxi-infection sont :
• La consommation d’aliments crus (viandes crus, poissons, coquillages crus lait crus…..etc.).
• La manipulation des aliments par des personnes ne respectant pas l’hygiène ou infectées.
• Le nettoyage insuffisant des aliments et des ustensiles.
• Le chauffage insuffisant des aliments cuits.
• La contamination croisée entre un aliment cru et un aliment cuit.
• Le non-respect de la chaine de froid.
• L’utilisation d’ingrédients contaminés.
II -6-2-Principales toxi-infections alimentaires :
Avec la transformation des techniques agricoles et des procédés de conservation des denrées alimentaires (importance de la restauration hors domicile, de l’exotisme alimentaire), les
risques évoluent très rapidement. Parmi les toxi-infections alimentaires on peut citer : A-Intoxications :
Lors d’intoxications, les bactéries produisent leurs toxines en quantité importante dans l’aliment contaminé avant sa consommation (Rambaud et Rampal, 1993).
A-1 Agents responsables d’intoxications :
• Staphylococcus aureus :
Le terme intoxication serait plus juste dans le cas des staphylocoques, car c’est l’ingestion de la toxine et non du germe qui provoque la toxi-infection (Bourgeois et al, 1988).
Staphylococcus aureus a été découverts et isolés par Pasteur vers 1876 à partir du pus anthrax (Bugnicourt, 1995).C’ est une dores coccobactérie Gram positif de 0,5 à 1 µm de diamètre, groupé en amas, non sporulé, immobile, aéro-anaerobie facultatif, possédant une catalase, appartenant à la famille des Staphylococcaceae. (Figure 2) (Federighi, 2005).
Ces bactéries sont ubiquistes, saprophytes de l’homme et de l’animal.
14
Figure 2 : Staphylococcus aureus sous microscopes électronique à transmission.
(Figarella et al, 2004).
Stphylococcus aureus possède la capacité d’élaborer des toxines, ce germe exerce des propriétés toxinogènique et invasives à la fois (Bourgeois et al, 1988).
Après ingestion d’une denrée alimentaire contenant des entérotoxines staphylococciques, les signes cliniques apparaissent : diarrhée, céphalées, vomissement souvent accompagné par des diarrhées.
Staphylococcus aureus est résistantes à certains produits désinfectants mais elle est détruire par une pasteurisation. Par contre l’entérotoxine produite au cours de la multiplication du germe dans l’aliment est thermostable et peut être présente dans les aliments alors que toutes formes viable de la bactérie ont disparu, c’est la toxine qui provoque l’apparition des symptômes (Bourgeois et al, 1988).
Les préparations culinaires sont affectées par les personnes hébergeant les staphylocoques dans leur gorge, salive et lésions infectées.
Les aliments favorables à ce type de contamination sont généralement les produits carnés (surtout les viandes hachées), la charcuterie, et l’amidon (Brunet-Loiseau, 2005), le mécanisme de l’intoxication a staphylococcus aureus est résume dans la figure (3).
15 Figure 3 : Les vois d’intoxication à Staphylococcus aureus (Leyral &Vierling, 2001).
• Clostridium botulinum :
C’est un bacille à Gram positif, anaérobie strict, mobile par ciliature péritriche, formant spores déformantes (Federighi, 2005).Il est capable de produire des neurotoxines dans les conditions d’anaérobiose (Bourgeois et al. 1998). Une ébullition (100C°) de 10 min détruit la toxine, tandis que les spores hautement thermorésistantes supportent des températures de l’ordre de 120 °C ou d’avantage.
On distingue huit types de Clostridium botilium qui diffèrent par les propriétés antigéniques des toxines qu’elles produisent (A, B, C, D, E, Fet G). Le botulisme humain est associé aux types A, B, et E et exceptionnellement au type C et F alors que les types Cet D sont essentiellement responsables du botulisme animal. Le botulisme de type A est le plus grave et souvent mortel car sa toxine est la plus active de toutes les toxines.
Le botulisme n’apparait que dans les aliments conservés car trois conditions doivent être réunies : un milieu non acide, strictement anaérobie et une température entre +10°C et + 48°C (Brunet- Loiseau, 2005).
Staphylococcus aureus entérotoxiques Biotypes humains
Lait d’animaux malades (mammites).
Aliments à faible teneur en eau.
Aliment : pH voisine de 7 Riche en protéines.
Aliments contamines laissés 2 à 3 h à 20°C.
Multiplication de S.aureus.
Production de l’entérotoxine.
Aliments toxique.
Absorption de la toxine préformée.
Intoxication
• Escherichia coli :
Escherichia coli a été isolé par Théodore Escherich en 1881 bacille, aéro-aneorobie facultatif
récente de l’eau et des aliments
Figure 4 : Escherichia coli (Barq
Escherichia coli est un hôte normal de la microflore digestive de l’homme et de nombreuses espèces animales (les bovins particulièrement). Certains sérotypes seulement sont pathogènes dont Escherichia coli O : 157
d’hygiène au cours de l’abattage du bétail ou la préparation des aliments ne sont pas respectées (Branger et al, 2007).
Elles peuvent être présentes également dans de nombreux aliments crus et elles passent facilement dans les aliments cuits du fait de la c
plans de travail, des récipients et appareils divers. En cas d’hygiène insuffisante et d’absence générale des moyens d’assainissement, un nombre important de
enfants risquent d’être contaminé
• Les mycotoxines : Une mycotoxine est un
aliment contenant cette substance en quantité suffisante provoque une consommateur (Bourgeois et al, 1988).
L’apparition et la survie des
température, l’humidité, le pH du milieu et la
par Théodore Escherich en 1881 (Bugnicourt, 1995)
aneorobie facultatif, mobile, à Gram négatif, indicateur de contamination fécale aliments. Il s’agit de coliformes thermotolérants (Figure
E.coli
Cil
(Barq-Calberg et Dusart, 2003).
est un hôte normal de la microflore digestive de l’homme et de nombreuses espèces animales (les bovins particulièrement). Certains sérotypes seulement sont pathogènes : 157 :H7. Elle se trouve dans les aliments lorsque les règles
’hygiène au cours de l’abattage du bétail ou la préparation des aliments ne sont pas (Branger et al, 2007).
Elles peuvent être présentes également dans de nombreux aliments crus et elles passent facilement dans les aliments cuits du fait de la contamination des mains du personnel, des plans de travail, des récipients et appareils divers. En cas d’hygiène insuffisante et d’absence moyens d’assainissement, un nombre important des personnes, adultes ou enfants risquent d’être contaminées par la voie alimentaire (INSP, 2008).
métabolite toxique, élabore par moisissure. L’
aliment contenant cette substance en quantité suffisante provoque une intoxication (Bourgeois et al, 1988).
L’apparition et la survie des moisissures (figure 5) dépend de quatre facteurs , le pH du milieu et la présence de substance nutritives
16 (Bugnicourt, 1995). C’est un , mobile, à Gram négatif, indicateur de contamination fécale
(Figure 4).
coli
Cil
est un hôte normal de la microflore digestive de l’homme et de nombreuses espèces animales (les bovins particulièrement). Certains sérotypes seulement sont pathogènes Elle se trouve dans les aliments lorsque les règles
’hygiène au cours de l’abattage du bétail ou la préparation des aliments ne sont pas
Elles peuvent être présentes également dans de nombreux aliments crus et elles passent ontamination des mains du personnel, des plans de travail, des récipients et appareils divers. En cas d’hygiène insuffisante et d’absence personnes, adultes ou
moisissure. L’ingestion d’un intoxication chez le
de quatre facteurs : la nutritives adéquates
17 (eau et nutriments). La prévention se fait par déshydratation des produits, baisse de la température de stockage et par acidification du produit (Charreau et al, 2006).
Levure
Moisissure
Figure 5 : moisissures en cultures (Pechére, 2007).
Une mycotoxine provoque un désordre alimentaire qui n’est ni infectieux ni contagieux, ainsi, touts les moisissures n’élaborent pas de mycotoxine, elles ne sont pas toutes toxinogénes (Bourgeois et al, 1990).
De telles intoxications provoquent de façon passagère ou durable des troubles d’une ou plusieurs fonctions ; des altérations du foie, des riens, des centres nerveux, de la circulation sanguine ou du tractus digestif (Bourgeois et al, 1990).
Un grand nombre de matières premières destinées à l’alimentation humaine ou animale peut être contamine par des moisissures toxinogénes : blé, mais, arachide, cacao, fèves, orges, soja, houblon, farines de céréales, pain, pâtisseries réfrigérée ou congelée et denrées alimentaires (stockage domestiques) (Moll et Moll, 2000).
Les toxines sécrétées par les moisissures les plus dangereuses sont récapitulées dans le Tableau(5).
Tableau 5 : Moisissures produisant des mycotoxines.
Moisissures Toxines secrétées
Aspergillus Aflatoxines, stérigmatocystine, ochratoxine A.
Fusarium Trichothécénes (DON, NIV, Toxine T2, DAS), Zéaralénone, fumonisines, fusarines, monoliformine.
18 Penicillium Patuline, citrinine, penitrem A, acide cyclopiazonique, ochratoxine A.
Alternaria Alternariol, acide ténuazonique.
Claviceps Alcaloïdes de l’ergot.
(Moll et Moll, 2000).
B-Intoxination :
Contrairement aux intoxications, les intoxinations sont dus à une contamination massive et une multiplication des germes chez la personne, avec éventuellement, une production de toxines au niveau de l’organe cible. Les salmonelloses et les listérioses sont les plus répandues (Bonnefoy et al. 2002).
B-A-gents responsables d’intoxinations :
• Salmonelles :
Découvert en 1880 par EBERTH, isolée et cultivé en 1884 par GRAFFKY (Bugnicourt, 1995). Salmonella est décrite dans les infections septicémiques, dans les fièvres typhoïdes, paratyphoïdes des toxi-infections.
Ce genre appartiennent à la famille des entrobacteriaceae, ce sont des bacilles aéro-anaérobies facultatifs, à Gram négatif, mobiles par ciliature péritriche la plupart des Salmonelles sont phototrophes (Figure 6). (Feillet, 2001).
Toutes les espèces sont quasiment mobiles et peuplent les intestins des organismes atteints de Salmonellose (Feillet, 2001).
Salmonella typhi Figure 6: Salmonella typhi sous microscope électronique à balayage (Pechére, 2007).
19 Les salmonelles sont à l’origine du plus grand nombre d’intoxications alimentaires. L’eau est la principale cause lorsqu’elle ne subit pas de contrôle bactériologique (Brunet-Loiseau, 2005).
Une salmonelle suffi pour déclencher une toxi-infection alimentaire c’est pour cela que la norme n’autorise aucune présence de salmonelle.
A la cuisine, elles peuvent passer par aliments crus aux aliments cuits (contamination croisées), si elles sont présentes sur les mains du personnel, les ustensiles de cuisine ou sur les divers appareils.
Les signes cliniques de la salmonellose sont ceux d’une gastro-entérite fébrile avec diarrhée, vomissements et crampes abdominales.
Clostridium perfringens :
Appartenant à la famille des bacillaceae, c’est un bacille à Gram positif (Figure 7), anaérobie strict, immobile, produisant des spores, classé dans le groupe des anaérobies-sulfito-réducteurs (Bourgeois et Leveau, 1988).
Figure 7: Clostridium perfringens (Barq-Calberg et Dusart, 2003).
Le réservoir de Clostridium perfringens est le sol ainsi que le tube digestif des porteurs sains.
Clostridium perfringens est divisé en 5 toxinotypes : A, B, C, D et E, il se présente sous sa forme végétative lorsque le milieu est sans oxygène, avec une température entre +10°C et +52°C et un pH de 5 à 8.
Lorsque les conditions sont défavorables ou lorsque le refroidissement ou la réfrigération ne sont pas efficace, Clostridium perfringens forme des spores (Brunet-Loiseau, 2005). Elles ne
20 sont pas détruites par la cuisson ou la pasteurisation, elles le sont par la stérilisation à chaleur humide, elles sont également relativement résistantes à certains désinfectants.
II -6-3-Toxi-infections alimentaires collectives :
Une toxi-infection alimentaire est une infection digestive contractée par ingestion alimentaire souillés par différentes bactéries et leurs toxines (Larousse, 2005).
Une toxi-infection alimentaire collective (TIAC) définie comme étant l’apparition d’une symptomatologie identique, chez deux personnes au moins pouvant se rapporter à une même origine alimentaire (Leyral et Vierling, 2001).
Les études épidémiologiques des toxi-infections alimentaires collectives mettent en évidence deux notions :
-Les aliments à risques : ceux qui sont consommés crus ou peu cuits (lait cru et fromage au lait cru, œufs, mayonnaise, fruits de mer, poissons, viandes saignantes).
-Les personnes à risque : sujets âgés, immunodéprimés , enfants en bas âge.
La progression des toxi-infections alimentaires collectives dans la plupart des pays traduit l’évolution des comportements alimentaires.
Des maladies infectieuses sont causées essentiellement par la consommation d’aliments crus d’origine animale et constituent une menace pour la santé publique. D’autre part, le recours croissant à la préparation industrielle des repas et à la restauration collective, fait que les employés servent, en général un nombre des repas très élève en un laps de temps très court, ce qui diminue les pratiques hygiéniques.
21
21 Objectif et Lieu du travail :
Nous avons réalisé notre projet de fin d’études au laboratoire d’hygiène de la wilaya de Blida, durant la période de Mars à Juin 2014.
L’objectif principal de notre étude est de s’assurer que la qualité hygiénique des plats du restaurant universitaire de Soumaa « Blida » en réalisant une analyse microbiologique, en particulier, bactériologique qui porte essentiellement sur la recherche des germes indiqués dans le journal officiel Algérien N°35/1998.
I -Matériel :
I-1- Produits analysés :
Les produits analysés sont des plats cuisinés :
-A base de viande (viande hachée « boulette », Kachir « tranche », poisson, volaille).
-A base de légumes (légumes secs, salades vertes, les pates en sauce).
I -2-Matériel de prélèvement, de conservation
Il comprend les éléments suivant :
• Une glacière contenant 3 à 4 unités de carboglaces congelées, qui sert à transporter les échantillons sous régime de froid.
• Porte aliment de matière inox stérile.
• Une cuillère stérile pour le prélèvement.
I -3-Conservateur :
La conservation des échantillons des repas de diner ce fait par l’utilisation d’un réfrigérateur domestique dont la température est maintenue entre 0 et +4°C.
I -4-Matériel de laboratoire :
Il s’agit des équipements usuels de laboratoire de microbiologie alimentaire dont la liste figure en annexe 1.
I -5-Milieux de culture et réactifs :
Les réactifs et milieux de culture utilisés pour notre analyse ainsi que compositions sont présentés en annexe 2.
22 II - Méthode :
II -1- Echantillonnage :
Sur une période de trois mois, des échantillons sont prélevés de façon aléatoire au niveau du restaurant de la cité universitaire de Soumaa. Ils ont subi une analyse microbiologique au sein du laboratoire de bactériologie alimentaire à Blida.
Les 60 prélèvements sont effectués sur différents plats constituant les repas de déjeuner et les repas de diner, répartis en :
-25 prélèvements sur des plats à base de viande.
-35 prélèvements sur des plats à base de légumes.
Remarque : Tous les renseignements concernant le restaurant universitaire, la date et la composition, la nature du prélèvement seront mentionnes dans la fiche représentée en annexe 3.
II -2 -Méthode de prélèvement:
Lors des prélèvements des échantillons, deux paramètres ont été pris en considération : Le premier paramètre consiste à s’assurer que le prélèvement est représentatif du plat à analyser, le second paramètre est bactériologique : il est primordial d’éviter de modifier la microflore du plat.
Ainsi, un échantillon d’environ 25g de chaque aliment à analyser (entrée, plat et dessert) a été aseptiquement prélevé dans un sac stérile et conservé dans la glacière pour être enchainer au laboratoire.
II -3-Ecouvillonnage :
Pour les prélèvements des surfaces (mains des personnels, des équipements qui sont en contact avec la préparation des aliments et des surfaces des locaux), nous avons fait recours à la méthode d’écouvillonnage. Cette analyse se fait par des écouvillons stériles en tube plastiques.
Le principe de cette méthode est de faire le prélèvement par frottement de surface des mains du personnel ou des équipements. Après, nous avons noté dans la fiche de prélèvement d’écouvillon l’heur, le lieu de prélèvement et la surface prélevée.
Les germes recherches sont les germes totaux, coliformes fécaux et les Staphylococcus aureus lesquels constituent les indicateurs de non respect des règles d’hygiène.
23 II -4- Transfert des échantillons au laboratoire :
Le transfert des échantillons à été assuré à des températures voisines de 4°C dans une glacière contenant 3 à 4 unités de carboglaces. La distance entre le lieu de prélèvement et le laboratoire est trente « 30 » minutes en véhicule.
II -5 - Méthodes d’analyses microbiologiques :
La recherche des germes a été effectuée suivant les critères microbiologiques préconisés par l’arrêté interministériel (annexe 4) relatif aux spécifications microbiologiques des plats cuisinés, publié au JORA N° 35 du 27 mai 1998, en procédant par la technique des suspensions-dilutions.
Les germes recherchés sont :
• Les germes totaux (Flore aérobie mésophile à 30°C).
• Les coliformes totaux à 37°C.
• Les coliformes fécaux à 44°C.
• Les Clostridium sulfito-réducteurs à 46°C.
• Les Staphylococcus aureus (Staphylocoques dorés)
• Les salmonelles.
II -5-1- Préparation de la solution mère et des dilutions décimales :
Une quantité de 25g de chaque échantillon est aseptiquement prise à proximité immédiate d’une flamme, après broyage au stomacher, cette quantité est ajoutée à un volume de 225 ml de Tryptone Sel Eau (TSE), réalisant ainsi une solution mère à 10-1 à partir de laquelle sont préparées les autres dilutions décimales (10-2 et 10 -3).
1ml 1ml 1ml
Solution mère 9 ml eau physiologie 9 ml eau physiologie 9 ml eau physiologie
225ml TSE 10-1 10-2 10-3
Figure 8: Schéma de la préparation de la solution mère et des dilutions décimales.
24 II -5-2-Recherche et dénombrement des différents micro-organismes :
a- Dénombrement de la flore mésophile totale à 30°C (germes totaux) Selon la norme ISO 4333 :
La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) est un indicateur de la qualité hygiénique qui permet d’évaluer le nombre d’Unités Forman Colonie (UFC) présentes dans un produit et nous fournit une idée générale sur la qualité microbiologique du produit.
La méthode consiste à prélever à l’aide d’une pipette stérile un volume de 1ml de la suspension mère et le mettre dans une boite de Pétri. De la même manière, les autres suspensions 10-2 ,10-3 sont ensemencées, en changeant évidement de pipette à chaque dilution.
On verse ensuite, dans chaque boite, un volume 20 ml de gélose TGEA préalablement fondue et laisser refroidisse à 42c°, réalisant ainsi un ensemencement en masse.
L’homogénéisation du mélange (inoculum et milieu) se fait avec des mouvements circulaires et de va-et-vient horizontaux. Après refroidissement des boites, ces dernières sont placées, faces retournées, dans une étuve à 30°C, et incubées pendant une durée de 72h (Figure 9).
Lecture et interprétation :
Retenir deux dilutions successives (plus fortes dilutions) où le nombre de colonies dénombrées soit : 15≤ C≤ 300.
Appliquer la formule suivante :
=
∑ ∁ ,Si vous prenez les résultats d’un plat pour chaque examen (dilution), et lorsque nous avons utilisés un seul examen (répétition) dans chaque dilution donc on a reformulé la règle :
= ∑ ∁ 1,1
∑ C : C1 +C2 / C1 : nombre de colonies de la 1ere dilution.
C2 : nombre de colonies de la 2eme dilution.
d : le taux de la 1ere boite retenue.
N : nombre de micro-organismes /gr ou ml.
25
1ml 1ml 1ml
+
20 ml de gélose TGEA
Homogenèsation
Incubé à 30°C, 24, 48,72h.
.
Colonies lenticulaires en masse.
Figure 9: Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux.
10-1 10-2 1O-3
26 b- Dénombrement des coliformes (selon la norme ISO 4831 et ISO 17025) : (Figure 10)
La méthodologie proposée est celle de la colimétrie en milieu liquide qui permet la caractérisation et le dénombrement des coliformes. Cette méthode permet d’étudier un caractère difficilement mis en évidence en milieu solide, production du gaz au moyen d’une cloche. De plus, elle permet un dénombrement avec une phase de réactivation. Elle comporte deux temps :
- La recherche présomptive.
- La recherche confirmative.
Test de présomption :
- Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif (BLBVB) à raison de trois tubes par dilution.
- A partir des dilutions décimales 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée.
- Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélangé le milieu et l’inoculum, on incube les coliformes à 37°C pendant 24 à 48 heures (Figure 10).
lecteur :
- Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :
un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche), un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune.
- La lecture est basée sur des données statistiques. Des tables de Mac Grady donnent pour chaque nombre caractéristique le nombre le plus probable (NPP).
Exemple :
Le nombre caractéristique est donc « 321 » ; ce qui correspond sur la table de Mac Grady au nombre 20.
Inoculum V B L. Test de Présomption Nombre caractéristique
+ + + 3
+ + - 2
- - + 1
27 On considère alors qu’il y a Coliformes par gramme de produit à la dilution de 10-1. Pour obtenir le nombre réel de Coliformes totaux, il suffit de multiplier ce nombre par l’inverse de la première dilution pour revenir à 1 soit :
20X 10 = 200 Coliformes totaux par gr de produit à analyser.
Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :
C’est un test qui est réservé à la recherche des coliformes fécaux.
A partir des tubes positifs :
Prélever 1ml et ensemencer dans le milieu BLBVB et dans une Eau Peptonée Exempte
Prélever 1ml et ensemencer dans le milieu BLBVB et dans une Eau Peptonée Exempte