Backtrajectories

Neste trabalho, as técnicas empregadas no desenvolvimento do método analítico por CLAE consistem em um estudo para dominar a escolha da fase móvel a ser empregada na análise, pois a perfeita separação de compostos na mistura somente tem sucesso se for possível inserir uma fase móvel correta a partir de uma fase estacionária conveniente. Com o objetivo de identificar as melhores condições de resolução e separação dos picos dos compostos orgânicos alvos, foram investigados diferentes composições de fases móveis antes dos testes experimentais.

As análises CLAE utilizadas em todas as quatro etapas descritas, referentes aos dois modos operacionais (MO1 e MO2) usados, foram executadas utilizando-se um sistema modular Shimadzu-Prominence, modelo da bomba (LC-20AT), degaseificador (DGU-20As), módulo (CBM-20A), detector (SPD-20A/UV/VIS), forno (CTO-20A) com sistema integrado de aquisição de dados (Figura 27).

Figura 27: Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE).

Na primeira etapa da pesquisa, usando o MO1 e na segunda etapa, aplicando o MO2, a coluna empregada na análise CLAE foi a CLC-ODS(M)/(C-18) de (150 mm de comprimento e 4,6 de diâmetro, Shimadzu), para detecção dos compostos fenólicos e seus intermediários aromáticos instáveis. O modo de eluição usado foi o isocrático (composição da fase móvel constante durante toda análise), temperatura do forno (400C), volume de injeção (20 μL), composição da fase móvel (20% acetonitrila e 80% água Milli-Q Ultra Pura), vazão da fase móvel (1,0 mL.min-1) e comprimento de onda do detector UV de 254 nm para determinar para- benzoquinona e 270 nm para identificar o fenol, catecol e hidroquinona. Os reagentes utilizados foram: fenol (99% P.A., marca DINÂMICA) e acetonitrila UV/HPLC (99,9% P.A., marca VETEC).

Na terceira e quarta etapa deste trabalho, utilizando o MO2, a coluna empregada na análise CLAE foi a CLC-ODS(M)/(C-18) de (250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro, Shimadzu), a fim de determinar em ambas as etapas (3 e 4) a concentração de fenol e seus respectivos intermediários aromáticos (principalmente catecol, hidroquinona e para-benzoquinona). O modo de eluição usado também foi o isocrático, temperatura do forno (350C), volume de injeção (20 μL), composição da fase móvel (10% metanol e 90% água/ácido fosfórico com um pH ajustado para 2,2), vazão da fase móvel (0,75 mL.min-1) e comprimento de onda do detector UV de 254 nm para determinar para-benzoquinona e 270 nm para identificar o fenol, catecol e hidroquinona. Os reagentes utilizados foram: fenol (99% P.A., marca DINÂMICA), metanol UV/HPLC (98,5% P.A., marca DINÂMICA) e ácido fosfórico UV/HPLC (85% P.A., marca DINÂMICA).

3.4.2.a Validação da Metodologia para Análise CLAE

- Preparação dos Padrões

Inicialmente foram pesados separadamente cada um dos padrões dos compostos orgânicos (fenol, hidroquinona, catecol e para-benzoquinona) em balança analítica com precisão de 4 casas decimais, valores equivalentes a 1,0000 g. A Tabela 17 apresenta a descrição dos padrões de cada um dos compostos orgânicos (data de fabricação, lote e fabricante). Essas alíquotas foram diluídas em água deionizada em balões volumétricos aferidos para 100 mL, a fim de obter uma concentração de cada composto orgânico de 2000 mg.L-1.

Tabela 17: Especificação dos produtos (fenol, hidroquinona, catecol e para- benzoquinona).

Composto Orgânico Fabricante Lote Data de Validade

Fenol CHEM SERVICE 463-49A 03/17

Catecol CHEM SERVICE 468-126A 06/15

Hidroquinona CHEM SERVICE 456-90B 12/14

Para-benzoquinona CHEM SERVICE 463-151B 04/13

A partir da preparação da solução padrão (estoque) com concentração igual a 2000 mg.L-1, foram realizadas diluições para 10 diferentes concentrações (300, 500, 700, 850, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 e 1500 mg.L-1) de fenol, hidroquinona, catecol e para-benzoquinona separadamente, sendo logo em seguida analisados através do equipamento de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, da Shimadzu, disponível no Departamento de Engenharia Química DEQ/UFPE). A coluna utilizada foi ODS apresentando 25 cm (comprimento) x 4,6 mm (diâmetro interno) x 5 μm (espessura da fase estacionária). A fase móvel utilizada foi composta de água acidificada com ácido fosfórico, e metanol numa proporção de (90:10), respectivamente com fluxo de 0,75 mL.min-1. A temperatura do forno foi mantida em 35ºC, conforme o item 3.4.2. A necessidade da preparação da solução estoque de 2000 mg.L-1foi de suma importância, devido a possibilidade de minimizar o número de erros operacionais em relação à preparação de várias soluções padrões.

- Linearidade

A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado (LANÇAS, 2009). A quantidade de pontos necessária para a confecção de uma curva analítica é variável em função da referência consultada, assim como o número de replicatas (RIBANI et al., 2004; THOMPSON et al., 2002). Todavia, é recomendado no mínimo cinco níveis de concentração, e um número de replicatas em cada nível similar ao empregado na rotina de trabalho (INMETRO, 2010).

Foram construídas duas curvas analíticas com cinco pontos cada, sendo as faixas de concentração de (300 a 1000 mg.L-1) e (1100 a 1500 mg.L-1). Os gráficos destas curvas de calibração são representados na equação da reta, conforme a Equação (80):

y = ax + b (80)

sendo:

y = variável dependente; x = variável independente;

a = coeficiente angular que expressa a inclinação do gráfico em relação aos eixos; b = coeficiente linear que expressa à interseção do gráfico com os eixos.

Para análise da linearidade foi realizado o cálculo do coeficiente de correlação (R2) para cada curva de cada um dos compostos orgânicos (fenol, hidroquinona, catecol e para-benzoquinona).

- Precisão

A forma mais adequada de determinar a precisão é através da estimativa do desvio padrão absoluto (s), de acordo com a Equação (81) (RIBANI et al., 2004; apud NAPOLEÃO, 2011).

1 2         



x= a média aritmética do número de medições; xi = o valor individual da medição;

n = o número de medições.

Outra maneira de calcular a precisão é através do desvio padrão relativo ou Coeficiente de Variância (CV), conforme a Equação (48).

- Repetitividade

Para obtenção da repetitividade, foram realizadas sete leituras de cada uma das concentrações dos padrões dos compostos orgânicos estudados. Os valores obtidos para cada uma destas foram analisados estatisticamente a fim de verificar a concordância com os dados das medidas realizadas. Para que fosse possível determinar se os resultados obtidos eram possíveis de serem considerados foi realizado o teste de Grubb’s de acordo com Oliveira (2008), além de levar em consideração parâmetros importantes tais como: estimativa do desvio padrão absoluto (s) e CV.

- Exatidão

A exatidão foi observada de acordo com o método de recuperação. Esta se baseou na adição de padrão; para tal foram escolhidas duas concentrações em cada uma das curvas analíticas estudadas. Nessas concentrações (500 e 700 mg.L-1; 1100 e 1200 mg.L-1) foi adicionado uma solução estoque de 300 mg.L-1. Também foram realizadas as leituras de outras concentrações (800 e 1000 mg.L-1) e uma vez obtidos os valores, foi determinado o cálculo de extidão, conforme o cálculo da recuperação, representado na Equação (82) (RAIMUNDO, 2007).

100 (%) 3 2 1 _x C C C R _        (82) sendo:

C1 = Concentração determinada na amostra com adição do padrão; C2 = Concentração determinada na amostra sem adição do padrão; C3 = Concentração do padrão adicionado.

- Limite de Quantificação (LQ)

O Limite de Quantificação (LQ) representa a menor quantidade do analito que pode ser quantificado com segurança, ou seja, com um nível aceitável de exatidão e precisão (INMETRO, 2010). O LQ foi obtido através da relação entre a estimativa do desvio padrão da resposta e a inclinação da curva analítica, descrita no item 2.5.3 conforme representado na Equação (47) (INMETRO, 2010; RIBANI et al., 2004).

- Limite de Detecção (LD)

O Limite de Detecção (LD) foi obtido através do método baseado em parâmetros da curva analítica, descrita no item 2.5.3 utilizando a Equação (45) (PASCHOAL et al., 2008; RIBANI et al., 2004). O LD pode ser entendido como a menor concentração do analito, podendo ser distinguido do branco com um determinado limite de confiabilidade (THOMPSON et al., 2002; INMETRO, 2010).

3.5 DEFINIÇÕES DE PARÂMETROS OPERACIONAIS E GRANDEZAS