L’identification des protéines impliquées dans l’ARNi est une étape nécessaire à la compréhension des mécanismes d’actions et de fonctions de ce mécanisme. Chez d’autres organismes, l’ARNi implique des protéines appartenant à plusieurs familles : les « RNA dependent RNA polymerase » (RdRp), les ARN hélicases, les RNases III de la famille 3 (Dicer) et les protéines Argonaute/Piwi. Par analyse bio-informatique du génome de T.
brucei, nous avons recherché les homologues de ces gènes.
Nous avons identifié deux protéines TbAGO1 et TbPWI1 appartenant à la famille Argonaute/Piwi, (figure 26). La protéine TbAGO1 possède les domaines PAZ et piwi, alors que TbPWI1 ne possède que le domaine piwi et au contraire de TbAGO1 et est retrouvée chez T. cruzi et Leishmania n’effectuant pas l’ARNi (voir article Chapitre II. B. a). Les deux gènes étant exprimés chez la forme procyclique, nous les avons clonés et séquencés pour les étudier (TbAGO1 : DB source AY433802.1, TPWI1 : DB source AY4338803.1 en annexe). Les gènes ont été éteints par ARN interférence via le système « pZJM » (Wang et al., 2000) qui permet l’expression d’ARNdb à partir de deux promoteurs inductibles faisant face et encadrant un fragment des gènes d’intérêts (figure 27) (voir les différentes lignées en annexe). Plusieurs lignées pZJM-TbAGO1 induites par rapport aux non induites et au contrôle non-induit présentent un léger retard de croissance. Par contre les lignées pZJM-TWI1 induites ne présentent pas de phénotype de croissance particulier. Ces expériences sont toutefois délicates vu qu’on utilise l’ARNi pour étudier des gènes potentiellement impliqués dans l’ARNi. Nous avons poursuivi l’étude de ces gènes au chapitre suivant.
Trypanosoma brucei, à l’inverse de T. cruzi (DaRocha et al., 2004), est capable de fragmenter les grands ARNdb en petits fragments, suggérant une activité Dicer (Djikeng et al., 2001). Nous avons donc recherché et identifié plusieurs RNases III (reconnaissable à leur domaine catalytique) mais aucune ne possède toutes les signatures (hélicase, PAZ, dsRNAdb) de Dicer. Nous avons remarqué qu’un candidat nommé RBN (GeneDB Tb08.26A17.170)(figure 26) est de taille similaire aux Dicer chez les autres espèces et est exprimé chez la forme procyclique. Nous avons généré et analysé des mutants ARNi pZJM-RBN, mais les lignées induites et non induites ne présentent pas de défauts particuliers dans la mitose et la croissance (figure 27).
91
Figure 26 Représentation schématique des protéines TbAGO1, TbPWI1 et RBN
Les zones cylindriques et colorées ont été identifiées par Pfam, base de données cataloguantles domaines conservés. Le point isoélectrique (pI) a été calculé par le programme pI/MW tool d’EXPASY.
TbAGO1 892 aa/ PM 98 KDa/ pI 9,28
aa 278-411 aa 278-411 ( (PfamPfam)) aa 547-877 aa 547-877 ( (PfamPfam)) aa 1-63 aa 1-63 ( (PfamPfam)) Nter
Nter RGGRGGboxbox PAZ PAZ PIWI PIWI Cter Cter
aa 412-546
aa 412-546
aa 64-277
aa 64-277
TbPWII 1102 aa/ PM 122,5KDa/ pI 9,13
aa 1-782
aa 1-782
Nter
Nter PIWI PIWI Cter Cter
aa 783-1081 aa 783-1081 ( (PfamPfam)) RBN 1648 aa/ PM 186,7 KDa/ pI 5,86 Cter Cter aa 839-1648 aa 839-1648 Nter Nter RNAse III RNAse III aa 1-715 aa 1-715 aa 716-838aa 716-838 ( (PfamPfam)) Figure 27 Analyse de la
croissance cellulaire au cours du temps des lignées induites et non induites à la tétracycline.
Le témoin PFRAi (Durand- Dubief et al., 2003) cible un gène de la fibre paraflagellaire n’affectant pas la croissance cellulaire chez la forme procyclique.
Trois lignées ayant intégré le plasmide pZJM (contenant le gène d’intérêt) ont été étudiées : Les lignées pZJM-TbAGO1 a, b et c ; pZJM-TbPWI a, b et c et pZJM-
92
D’autre part, nous n’avons pas pu étudier d’implication directe dans l’ARNi, car la lignée hôte nécessaire pour contrôler le pZJM (lignée 29-13 voir matériels et méthodes et annexe) répond difficilement à l’ARNdb en condition transitoire.
Nous avons également effectué des recherches au niveau des ARN hélicase et identifié de nombreux candidats dans le génome du trypanosome (>40). Cependant l’absence de signature caractéristique de l’ARNi de ces enzymes et l’abondance de ces hélicases ne nous a pas permis d’identifier des candidats spécifiques. D’autres recherches ont été effectuées pour trouver la RdRP, rde-4 et FMRX mais se sont avérées sans succès.
La protéine Mdp2 co-exprimée avec la protéine Argonaute Mdp1 est lors du développement du macronoyau chez le cilié Stylonychia lemnae (Fetzer et al., 2002). Etant donné la contribution des protéines Argonaute et de mécanismes apparentés à l’ARNi dans ce processus chez un autre cilié Tetrahymena (Mochizuki et al., 2002). Nous avons suspecté que Mdp2 pouvait aussi participer à l’ARNi. Nous avons analysé deux homologues de la protéine Mdp2 retrouvés chez T. brucei (Gene DB : Tb04.29M18.690, Tb04.29M18.71
)
. Les deux gènes Mdp2 sont exprimés au stade procyclique (données non montrées) et sont de séquences quasiment identiques (>90% d’homologie globale). Nous avons donc ciblé conjointement ces deux homologues par ARNi à l’aide du vecteur pZJM. Après induction, l’analyse de trois clones pZJM-Mdp2 montre une réduction dramatique de la croissance dès 24h (figure 28). L’analyse au DAPI démontre que les lignées induites pZJM-Mdp2 ont de sérieux problèmes dans le cycle cellulaire (figure 29).Figure 28
Analyse de la croissance des lignées pZJM-Mdp2 (a,b et c) induites et non induites à la tétracycline.
Les lignées sont induites avec 1µg/ml de tétracycline.
La lignée pZJM-PFRA (PFRAi) est un contrôle où la croissance n’est pas affectée (Durand- Dubief et al. MBP 2003)
93 Figure 29
Phénotype observé après extinction de Mdp2
A/ Lignée contrôle PFRAi exprimant l’ARNdb de PFRA B/ Lignée pZJM-Mdp2a C/ Lignée pZJM-Mdp2b D/ Lignée pZJM-Mdp2c. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde 4% et colorées au DAPI (bleu). Les images en contraste de phase et en fluorescence ont été superposées.
Résultats
3
ème
partie :
96