B) Multiciblage

Les progrès de la biologie montre l’enchevêtrement des voies de signalisation cellulaire qui lorsqu’elles sont dérégulées conduisent à une pathologie. Ce fait est contradictoire avec la conception de nouveaux médicaments dirigées contre une seule cible thérapeutique, ce concept étant toujours majoritairement suivi pour obtenir des molécules spécifiques^163,164. Un article de revue récent montre que depuis une dizaine d’année, les molécules thérapeutiques efficaces ciblent en fait plus d’une cible thérapeutique¹⁶⁵. Cette observation peut être liée à la découverte fortuite de nouvelles cibles pour une molécule conçue au départ pour un ciblage simple et/ou à la recherche rationnelle de molécules dirigées directement contre plusieurs cibles. L’imatinib, un inhibiteur de plusieurs tyrosine kinases possède un meilleur effet anticancéreux que le gefitinib que est dirigé contre une seule cible¹⁶⁶. Récemment, ce concept de multiciblage a été utilisé pour mettre au point un nouvel inhibiteur de kinase de la voie phosphatidylinositol 3-kinase bloquant la phosphorylation de 5 protéines kinase permettant d’augmenter l’effet antitumoral¹⁶⁷. Enfin, ce concept de multiciblage est directement validé par l’efficacité de la combinaison de molécules thérapeutiques qui est pratiquement toujours utilisée dans le traitement du cancer et d’autres maladies¹⁶⁵.

Des études par analyse globale permettent par des approches de bioinformatique de cartographier des cibles protéiques impliquées dans une pathologie. Par exemple comme indiqué dans la Figure 15, une analyse globale de facteurs de transcription impliqués dans le cancer colorectal montre notamment que les facteurs de transcription NF-κB, Stat3 et Ets1 participent à différents aspects du développement de cancer.

Figure 15. Analyse globale de facteurs de transcription impliqués dans le cancer colorectal D’après Pradhan et coll¹⁶⁸

Un autre exemple est indiqué dans une revue récente¹⁶⁹ qui montre des interactions fonctionnelles entre les facteurs de transcription Stat3 et κB dans le cancer. Stat3 et NF-κB sont régulés par des mécanismes moléculaires différents. Néanmoins, ces 2 facteurs de transcription sont des activateurs d’un état cellulaire malin et contrôlent l’expression des gènes cibles impliqués pour la prolifération cellulaire, la survie, l’angiogénèse, la réparation tissulaire^170–173. Stat3 se lie à 3000 promoteurs de gènes différents et le nombre de gènes ciblés par la famille NF-κB est bien supérieur¹⁶⁹. Si Stat3 et NF-κB peuvent contrôler chacun de façon indépendante l’expression d’un gène (Figure 16A), ces 2 facteurs de transcription co-régulent l’expression de gènse (Figure 16B). Ainsi, dans des cellules malignes, si des gènes anti-apoptotiques comme A1 et c-FLIP sont principalement NF-κB dépendants et d’autres comme Mcl-1 et Survivin sont Stat3 dépendants, les gènes Bcl-xL, Bcl-2 et c-IAP2 sont activés par les 2 facteurs (pour revue ¹⁶⁹). De la même façon, l’inhibition de Stat3 ou de NF-κB conduit à l’augmentation de p53 dans la cellule, l’inhibition des 2 protéines induit donc une augmentation plus importante de p53.

Figure 16. Intervention de NF-κB et de Stat3 dans le contrôle de la transcription En A, Stat3 et NFκB peuvent activer de façon indépendante un gène sous leur dépendance En B, Stat3 et NF-κB doivent interagir entre eux pour activer le gène sous leur dépendance D’après Grivennikov et Karin¹⁶⁹

De la même façon, certaines cytokines sont synthétisées sous le contrôle de NF-κB, Stat3 ou des 2 facteurs de transcription (Tableau 2). De façon intéressante, on peut constater que la cytokine IL-6 est sous la forte dépendance de NF-κB et de Stat3. Or, dans les cellules HNSCC (cellules du carcinome tête et cou), la production d’IL-6 est sous le contrôle de NF-κB (élément de reconnaissance de -75 à -63 pb avant le site d’initiation de la transcription d’IL-6) et de AP-1 (élément de reconnaissance de -286 à -265 pb avant le site d’initiation de la transcription d’IL-6). L’inhibition de NF-κB conduit à la diminution de l’expression d’IL-6 et d’autres cytokines (IL-8, IL-10, GM-CSF). Or, le blocage de NF-κB conduit également à une diminution drastique de l’activité constitutive de Stat3 dans les cellules^174,175.

Ces observations démontrent l’existence d’interconnexions entre les voies NF-κB et Stat3 dans les cellules HNSCC¹⁷⁶. A l’heure actuelle, il n’existe pas de stratégie à notre connaissance permettant un multiciblage efficace des facteurs de transcription NF-kB et Stat3.

Tableau 2. NF-κB et Stat3 contrôlent la production de cytokines D’après Grivennikov et Karin¹⁶⁹

Dans les cellules SCLC (petites cellules cancéreuses du poumon), il a été montré que la surexpression du facteur de transcription Nfib (régule l’expression de gènes permettant la différenciation du poumon) était corrélée à la surexpression de L-myc (proto-oncogène retrouvé dans les cellules SCLC). Ces 2 facteurs de transcription, sous certaines conditions dans les cellules SCLC, doivent donc agir de façon synergique¹⁷⁷. Enfin, l’équipe de Pau a fait un bilan des facteurs de transcription exprimés dans des cellules NSCLC (cellules cancéreuses du poumon). Les résultats obtenus montrent 19 facteurs de transcription exprimés avec 81 interconnexions entre eux. Ces facteurs de transcription contrôlent l’expression de 64 gènes cibles.

Ces résultats suggèrent fortement que le ciblage d’un seul facteur de transcription dans une cellule n’est pas suffisant pour obtenir un effet thérapeutique efficace. De même, l’inhibition d’un facteur de transcription ne conduit pas forcément à l’inhibition des gènes cibles désirés si le gène ciblé est régulé par plusieurs facteurs de transcription. Par conséquent, le développement d’une molécule permettant de cibler en même temps plusieurs facteurs de transcription devrait présenter une meilleure efficacité thérapeutique.

Un exemple de multiciblage développé actuellement concerne des éponges à microARN (miRNA)^178,179. Cette stratégie a été développée pour augmenter l’efficacité du ciblage d’un miRNA. En effet, il est connu que plusieurs miARN sont impliqués dans une fonction cellulaire en inhibant la transcription de multiples gènes. Il est par conséquent nécessaire de cibler en même temps plusieurs ARN-m différents. Le principe de cette stratégie est d’utiliser un ODN long contenant plusieurs copies d’une séquence complémentaire d’un miRNA cible (sorte de leurre à miRNA). La plupart du temps, c’est la transcription intracellulaire d’un plasmide contenant ces séquences qui est utilisé pour produire un ARN antimir sans codon de traduction. Chaque éponge à ARN peut piéger par hybridation jusqu’à 7 miRNA. Cette stratégie présente quelques inconvénients comme la formation de structures reconnues non spécifiquement par des protéines, la biostabilité et surtout le risque de s’hybrider sur d’autres séquences de façon non spécifique.

Dans la stratégie du leurre moléculaire, l’équipe de Wang a développé un leurre moléculaire ayant la propriété de posséder plusieurs éléments de reconnaissance de facteurs de transcription¹²⁶. Comme on peut le voir sur la Figure 17, les sites de NF-kB et E2F sont chevauchants et le site de Stat3 est situé à 3 nucléotides du site de NF-κB. Comme nous l’avons déjà remarqué précédemment, cet OLM ne peut pas interagir simultanément avec les 3 facteurs de transcription ciblés ce qui a été validé indirectement par les auteurs eux-mêmes dans leur conclusion. De plus cet OLM de 37 paires de base linéaire pourrait interagir avec la protéine Ku et donc déclencher le système de réparation des coupures double brin de l’ADN depuis que l’on sait que dans la stratégie « Dbait » un ODN est fonctionnel avec une longueur de plus de 32 pb. Afin de pouvoir incorporer plusieurs sites de liaison reconnus par des facteurs de transcription de manière non chevauchante, il serait nécessaire d’adapter la taille et la forme du leurre moléculaire.

Figure 17. Séquence du leurre moléculaire multisites utilisé par l’équipe de Wang D’après Gao et coll¹²⁶.

Un multiciblage de NF-kB et Ets1 a été reporté dans le but de réduire le risque d’anévrisme aortique abdominal dans un modèle animal (rat, lapin)^127,128. Comme on peut le voir dans la Figure 18, l’oligonudéoxynucléotide leurre moléculaire de 26 paires de base contient les sites séparés de Ets1 et NF-κB ; cependant, la protéine Ets1 interagit très faiblement avec un seul site consensus du fait de son mécanisme d’autoinhibition.

Figure 18. Séquence du leurre moléculaire multisites utilisé par l’équipe de Morishita D’après Miyake et coll¹²⁸.

Afin de réaliser un multiciblage protéique par la stratégie du leurre moléculaire, il est nécessaire de concevoir une nouvelle molécule d’ADN permettant la fixation de plusieurs protéines et si possible en répondant aux difficultés liées aux problèmes rencontrés en thérapie

génique. Pour cela, nous avons développé une molécule d’ADN non pas linéaire mais circulaire appelé minicercle d’ADN. Dans la suite, je ferai un bilan des connaissances sur les petits ADN de forme circulaire afin de comprendre leur intérêt aussi bien dans des études académiques que pour des applications thérapeutiques.