Avantages et inconvénients

Le séquençage de Sanger peut être utilisé pour détecter des mutations ponctuelles pour la caractérisation des hémoglobinopathies et des β-thalassémies(160,162). Les gènes de globine β et α sont relativement petits, 1,2 kb et 1,8 kb, respectivement, et facilement prête à un séquençage. L'amplification par PCR suivie d'un séquençage bidirectionnel est effectuée. Le séquençage peut être avantageux car il ne nécessite pas de ciblage séparé de chaque mutation (à la différence des méthodes ciblées) et il identifie également la mutation exacte (à la différence des méthodes de balayage. Le séquençage direct est alors une technique utilisée pour détecter les points de mutations, les petites délétions et les insertions qui causent les thal, aussi bien pour confirmer que pour caractériser un variant rare ou un nouveau variant.

En tout, le processus d'acquisition d'une séquence de sang total et de l'analyse peut prendre 4-5 jours, avec confirmation en utilisant un autre test basé sur le PCR. ). Le séquençage n’est pas bien adapté à la détection de grandes délétions / duplications.

75 3. Le Gap-PCR

Les délétions plus courantes peuvent être détectées par gap-PCR. Une fois que les points de rupture de délétion ont été définis et des amorces spécifiques des délétions sont conçues. Les délétions mises en évidence par cette méthode de PCR nécessitent des amorces choisies pour être très éloignées l’une de l’autre. Lorsqu’il n’existe pas de délétion, ces amorces ne permettront pas une amplification .En cas de délétion, les amorces sont rapprochées et l’ADN amplifié signe alors une délétion. (163)

Cette méthode est très utilisée et plusieurs laboratoires en sont déjà équipés. Comme elle est rapide et à moindre coût. La recherche des 7 délétions les plus courantes de l’α-thal est de routine. Contrairement aux β-thalassémies, les délétions sont une cause fréquente d'une α-thalassémie. Les délétions et les réarrangements des thalassémies courantes peuvent être détectés en utilisant régulièrement gap-PCR(140,164,165).

Ce principe a été utilisé dans la technique de le gap-PCR pour la HPFF commun et δβ-thalassémies (166). Le Gap-PCR est également couramment utilisé pour détecter l'Hb Lepore, un variant créé par déletion de 7 kb et donne un produit fonctionnel delta/bêta globine hybride (26).

4. La MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification =

amplification multiplex de sondes dépendant d'une ligation)

C’est une variante de la PCR multiplexe qui utilise une sonde séparée en deux, nécessitant la ligation des deux parties pour que l'amplification ait lieu. Deux oligonucléotides sont utilisés :

 Le premier contient à la suite une région correspondant à une première amorce de PCR et la première moitié de la sonde complémentaire de la région à détecter,

 Le second contient la deuxième moitié de la sonde suivie d'une région correspondant à la deuxième amorce de PCR.

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Le résultat d'une analyse par MLPA donne des carrées. Chaque carré correspond à une sonde. Les carrés se trouvent entre les deux lignes horizontales correspondent à une région présente en un nombre normal d'exemplaire.

Au cours de l'analyse, ces deux oligonucléotides se fixent sur l'ADN à analyser, au niveau de la région correspondant à la sonde. Comme les deux moitiés de la sonde se trouvent l'une à côté de l'autre, il est possible de les assembler par ligation. Il est alors obtenu une sonde complète liée à l'ADN étudié, avec de chaque côté une région non-liée sur laquelle il est possible de fixer une amorce. Cette sonde est détachée de l'ADN et l'on procède à une amplification par PCR avec les amorces choisies au début. Seuls les oligonucléotides ayant subi une ligation, c'est-à-dire ceux qui se sont liés au brin d'ADN, sont susceptibles d'être amplifiés. Ainsi, il est à éviter d'amplifier les oligonucléotides qui ne se sont pas liés à l'ADN cible. L'amplicon est détecté grâce à un marqueur fluorescent attaché aux amorces avant amplification.

Le principe de la sonde de ligature dépendant multiplex amplification est basé sur la détection des délétions ou duplications par amplification quantitative de la sonde multiple des paires hybridées dans le gène de l'α et β-globine clusters et régions voisines. La diminution ou augmenter dans le signal par rapport à la normale est un contrôle indicatif, respectivement, les délétions ou les duplications à travers le locus sont analysés

Cette méthode est une alternative intéressante ou une méthode complémentaire à Gap-PCR. Lors de l'étude des réarrangements connus et inconnus.

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Tableau 8 Les techniques de biologie moléculaire pour l'identification des hémoglobinopathies (32)

Type d’anomalies Type de Mutation Techniques disponibles β-thalassémie Mutation ponctuelle ARMS-PCR

ASO

Séquençage direct

Délétion Gap-PCR

α- thalassémie Délétion Gap-PCR

Southern blot

Non-délétionelle Amplification α1 ou α2 ARMS-PCR

ASO

Séquençage direct

variant Hb S Mutation ponctuelle ARMS-PCR

Séquençage direct variant Hb C Mutation ponctuelle ARMS-PCR

Séquençage direct variant Hb E Mutation ponctuelle ARMS-PCR

Séquençage direct variant Hb D^Punjab Mutation ponctuelle ARMS-PCR

Séquençage direct

variant Hb Lepore Délétion Gap-PCR

PHHF et δβ-thalassémie Délétion Gap-PCR

δβ-thalassémie Délétion Southern blot

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IV. Phase post-analytique : Interprétation des résultats

Un bilan standard pour la recherche d’une hémoglobine anormale » doit comporter 3 tests phénotypiques différents, dont au moins une technique électrophorétique avec interprétation.

Pour un diagnostic phénotypique précis, il est indispensable d’avoir en main :  Les données épidémiologiques

 Les renseignements cliniques  Les données hématologiques  Les données biochimiques.

Tout ceci est regroupé sur la fiche de suivi pour les hémoglobinopathies. Si des données manquent, le résultat sera rendu sous réserve de la fiche de suivi.

Pour l’interprétation, il faut se référer aux valeurs de référence établies par le laboratoire. À titre indicatif, quelques valeurs de référence sont les suivantes :

 Le profil d’étude de l’hémoglobine d’un nouveau-né à terme contient:  HbF = 70 à 85%

 HbA= 15 à 30%

 HbA2 non quantifiable.

 Le profil d’étude de l’hémoglobine d’un adulte contient :  HbA majoritaire (80 à 97%)

 HbA2 = 2,0 à 3,4% (valeur indicative, à déterminer en fonction de chaque technique)  HbF < 1 %.

NB : Il est à noter que l’on considère qu’à l’âge de 1 an, le profil d’étude de l’hémoglobine de l’enfant est équivalent à celui de l’adulte (en dehors de l’HbF, qui peut persister à des taux < 5 % jusqu’à 2-3 ans).

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A. Arbres décisionnels pour l’interprétation des cas simples des anomalies de