O ciclo de vida das células depende da divisão celular, tendo início assim que uma célula é dividida e o término quando esta célula se divide ou morre por apoptose ou necrose. O processo de divisão celular consiste na intérfase e na fase mitótica. A intérfase é determinada por uma organização celular em atividade constante, produzindo diversas substâncias, realizando processos físicos e químicos, é a fase em que ocorre a duplicação do material genético. As células permanecem no estágio da intérfase a maior parte de suas vidas (LODISH et al., 2005).
A intérfase é subdividida em três fases: G0-G1, S e G2-M. Durante a fase G0, a célula não recebe nenhum tipo de estímulo para a divisão celular, realizando exclusivamente a sua atividade celular. Quando há um estímulo para a divisão celular, a célula entra em G1, onde ocorre a síntese de muitas proteínas, entre elas, enzimas e RNA. Consequentemente, a célula aumenta seu tamanho nesta fase. A fase S apresenta, como característica, a replicação das moléculas de DNA para cada cromossomo existente. É nesta fase que cada cromossomo passa a ter duas cromátides ligadas por um centrômero. Durante fase G2-M, ocorre a síntese de tudo
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que é necessário para a formação de duas novas células, portanto, nesta etapa, devem ter duplicadas todas as organelas celulares (LODISH et al., 2005).
O ciclo celular é regulado por diversos fatores, sendo assim, este pode ser interrompido até determinada fase e só ter continuidade quando as condições ideais se mostrarem presentes, como uma quantidade ideal de nutrientes ou quando a célula atinge as dimensões apropriadas para a divisão. As células neuronais, em condições normais, param de se dividir quando o animal atinge o estado adulto e permanecem em G0 pelo resto da vida do animal.
No entanto, existem três momentos em que os mecanismos de regulação atuam. No final da fase G1, células que não têm as condições apropriadas para dar continuidade ao seu ciclo celular param e permanecem em G0. Além disso, caso sejam detectados erros no DNA que são impossíveis de se reparar, as células entram em apoptose. No final da fase G2-M, é verificado se a replicação do DNA ocorreu corretamente, caso contrário, o ciclo é interrompido e as células voltam para a fase S (LODISH et al., 2005).
A fim de se verificar a influência dos tratamentos com oligomicina e/ou antimicina A nas fases do ciclo celular em células U-87MG e T98G, analisamos por citometria de fluxo as fases da intérfase após um tratamento de 4 dias na presença dos inibidores mitocondriais citados acima. Os resultados em valores percentuais estão descritos nas tabelas III e IV, totalizando 100% das células em cada tratamento. Estes resultados também estão mostrados na figura 13, painéis B e C.
Na linhagem celular U-87MG, quando foi adicionado um inibidor da ATP sintase, oligomicina, ocorreu uma diminuição da porcentagem das células em G0-G1, um aumento de 2,09 vezes na fase S, e um aumento de 1,1 vezes na fase G2-M. Quando os tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foram realizados, percebeu-se uma diminuição significativa celular na fase G0-G1 e um aumento de 3,12 e 3,01 vezes na fase S quando as células foram tratadas com antimicina A e oligomicina mais antimicina A, respectivamente. Esse grande aumento percentual de células na fase S pode ser explicado por uma dificuldade em completar
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os processos da divisão celular na presença destes inibidores mitocondriais, parando em S, ou voltando da fase G2-M para a fase S. No entanto, quando observamos a porcentagem de células na fase G2-M nestes tratamentos, percebemos uma diminuição de 1,3 e 1,89 vezes no tratamento com antimicina A e oligomicina mais antimicina A, respectivamente. Essa queda pode ter ocorrido devido à diminuição do potencial de membrana mitocondrial, que é necessário para diversos mecanismos intracelulares, não favorecendo a proliferação celular, conforme discutido no item 4.3.
U-87MG
Tratamento G0-G1 (%) S (%) G2-M (%) Controle 79,93 13,5 6,57 Oligomicina 64,48 28,26 7,26 Antimicina A 52,82 42,16 5,02 O + AA 55,89 40,64 3,47Tabela III – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de
glioblastoma humano U-87MG relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular.
T98G
Tratamentos G0-G1 (%) S (%) G2-M (%) Controle 71,33 21,45 7,22 Oligomicina 70,30 22,44 7,26 Antimicina A 57,05 42,59 0,36 O + AA 66,64 30,72 2,64Tabela IV – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células
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O mesmo padrão percentual das fases da intérfase na presença dos tratamentos oligomicina e/ou antimicina A ocorreu com a linhagem T98G. Observou- se uma diminuição percentual em G0-G1, com consequente aumento na fase S e um pequeno aumento na fase G2-M quando tratadas com oligomicina. Já com os tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A, houve uma maior queda no percentual de células em G0-G1 quando comparado com o controle, aumentando consequentemente a porcentagem de células na fase S e uma significativa diminuição de células na fase G2-M. Os resultados devem ser interpretados da mesma forma como os das células U-87MG.
A figura 13, painel A, apresenta os histogramas obtidos em análises por um citômetro de fluxo em ambas as linhagens celulares estudadas, U-87MG e T98G. O primeiro pico representa a fase da intérfase G0-G1, o segundo pico representa as células que se encontram em G2-M e entre os dois picos estão as células na fase S, como mostrado na figura ilustrativa 12.
Fig. 12 – Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por um citômetro de
fluxo quando se avalia a intérfase do ciclo celular. O eixo X é representado pela
quantidade de DNA por célula, e o eixo Y pela quantidade de células que apresentam os valores de DNA estabelecidos no eixo X. O eixo X é avaliado por unidades arbitrárias de fluorescência e o eixo Y pela quantidade de eventos que o citômetro identificou (RESINO, 2014).
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Fig. 13 - Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das células de glioblastomas U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (7.000 células/cm2) foram plaqueadas em garrafas de 25 cm2 com 6 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, o meio foi renovado com a privação
do soro fetal bovino. Após 24 horas, o meio foi renovado novamente, com a presença de soro fetal bovino, e as culturas celulares receberam os tratamentos específicos: DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. Após 4 dias de tratamento com os inibidores mitocondriais, as células foram fixadas em etanol 70% e mantidas a -20°C por pelo menos 24 horas. Após processamento das amostras, as fases do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± S.E.M de 8 experimentos independentes.
Painel A: Histogramas representativos da análise do ciclo celular por citometria de fluxo. Painéis B e C: Porcentagens relativas das fases do ciclo celular após tratamentos nas
condições indicadas. *P<0,05, **P<0,01 vs DMSO. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.
4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na proliferação de astrócitos primários em cultura
Para verificar a taxa de proliferação de astrócitos provenientes de ratos neonatos foi utilizado o teste de redução do MTT com a produção de cristais de formazan (Fig. 14). Estas células foram escolhidas devido à origem astrocítica das células de glioblastoma humano utilizadas neste trabalho.
As células de astrócitos foram mantidas em cultura durante 6 dias, após este período pôde-se observar um aumento de 2,82 vezes na atividade metabólica de redução do MTT na situação controle, passando de um valor de absorbância de 0,084 no início do tratamento para 0,238 ao final dos 6 dias. Quando estas células foram tratadas com oligomicina ou antimicina A observou-se, ao final de 6 dias, uma proliferação celular semelhante às obtidas na condição controle, apresentando absorbâncias de 0,243 e de 0,226, respectivamente. Quando ambas as drogas estavam presentes, oligomicina mais antimicina A, as células acompanharam o crescimento observado nos demais tratamentos até o segundo dia, seguido por uma diminuição da atividade metabólica da redução do MTT ao final do sexto dia de aproximadamente 20,5% quando comparadas ao controle, indicando que a proliferação celular diminuiu significativamente.
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Conclui-se que os astrócitos tratados com as drogas oligomicina ou antimicina A conseguiram se proliferar em uma taxa similar aos de uma situação controle. Contudo, quando as drogas foram adicionadas simultaneamente, houve uma queda significativa em sua proliferação. Estes resultados indicam que há um prejuízo na proliferação de astrócitos quando estes não mantem um potencial de membrana mitocondrial.
A sobrevivência e proliferação de astrócitos na presença de inibidores mitocondriais, oligomicina ou antimicina A, pode ser explicada pelo comportamento glicolítico dos mesmos, assim como observado para as células de glioblastomas. Isto é, a maior parte da glicose captada por astrócitos é convertida à lactato que é utilizado por neurônios (MAGISTRETTI, 2006; RODRIGUES et al., 2013).
Fig. 14 - Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de astrócitos de ratos neonatos.
Astrócitos (15.000 células/cm2) provenientes de ratos neonatos (2 dias) foram dispostos em discos de 9,2 cm2 com 2 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h, o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. A figura apresenta os resultados de proliferação celular estimados pela redução de MTT com a produção de azul de formazan. Os dados representam a média ± S.E.M de pelo menos 6 experimentos independentes realizados em duplicata. **P<0,01 vs Control or Oligo.
Astrocyte 0 2 4 6 0.0 0.1 0.2 0.3 Control Oligo AA Oligo + AA
**
Days of Treatment Op ti c a l d e n s it y o f fo rm a z a n a b s o rb a n c e ( a .u .)Conclusões 52