A estatística univariada investiga cada variável separadamente, ou relaciona uma variável independente com uma variável dependente. No entanto, as reações bioquímicas e processos biológicos apresentam-se de forma multivariados, onde para uma boa caracterização do método de diagnóstico, muitas variáveis devem ser consideradas, favorecendo um aumento da qualidade na análise de dados.107
Dessa forma, essas análises envolvem normalmente a aplicação de modelos matemáticos, estatísticos e computacionais para pesquisar, interpretar e classificar os conjuntos de dados de interesse, sendo utilizada em diversas áreas cientificas, inclusive para avaliação de possíveis marcadores de doenças.108-109
A análise dos componentes principais (PCA, do inglês Principal Component
Analysis) corresponde a um modelo matemático não supervisionado que utiliza diversas
combinações lineares de variáveis, que nesse caso correspondem aos nucleosídeos de interesse, capaz de gerar componentes principais que contém a maior variação total dos dados. O modelo gerado pela PCA reduz, portanto, o número de dimensões dos dados, mantendo as características principais que contribuem para a variância entre os agrupamentos das amostras. Para gerar o modelo matemático de predição, a “[...] combinação linear responsável pela maior variabilidade nos dados é projetada no primeiro eixo, denominado de primeiro componente principal, e os demais componentes tem a máxima variância sob a restrição de serem ortogonais”.66,109-110
A análise de componentes principais foi aplicada aos dados de concentração dos nucleosídeos nas amostras de pacientes saudáveis e com câncer de próstata e pâncreas. O gráfico de escores mostra a discriminação de dois agrupamentos, grupo saudável e grupo com câncer (Figura 17).
Figura 17: Gráfico de escores (A) e gráfico de Loadings (B) por análise de componentes principais das amostras de pacientes saudáveis, com câncer de próstata e pâncreas.
P C 2 (6 % ) Lo ad in gs 2 PC 1 (92,1%) Loadings 1 Scores Plot Uridina 5-Metiluridina Xantosina Guanosina A B
A discriminação dos tipos de câncer não foi aparente. Porém, consegue-se uma boa separação do grupo saudável e dos indivíduos doentes. No gráfico de Loadings é apresentada a influência dos nucleosídeos na discriminação dos agrupamentos saudável e com câncer, sendo que quanto maior a concentração da guanosina maior a discriminação saudável
versus doentes.
Foi também determinado o mapa de calor (heatmap) que mostra o dendograma das amostras de pacientes saudáveis, com câncer de próstata e pâncreas associado com o dendograma dos nucleosídeos (Figura 18).
Figura 18: Dendograma das amostras de pacientes saudáveis, com câncer de próstata e pâncreas associado com o dendograma dos nucleosídeos.
Através do mapa de calor (Figura 18) é possível observar que a concentração de guanosina nas amostras de pacientes saudáveis (escala acima de zero, coloração salmão) é maior do que nas amostras de pacientes com câncer (escola abaixo de zero, coloração azul), revelando que a guanosina pode ser considerada como um possível biomarcador de pacientes saudáveis. Em situação contrária, a concentração de 5-metiluridina nas amostras de pacientes saudáveis é menor do que nas amostras de pacientes com câncer (próstata e pâncreas). Portanto, altas concentrações de guanosina associada com baixas concentrações de 5- metiluridina podem ser usadas para confirmação de pacientes saudáveis. O nível de concentração de uridina, 5-metiluridina e xantosina é maior nas amostras de pacientes com câncer, no entanto não diferem significativamente entre os pacientes com câncer de próstata e pâncreas, o que explica a distribuição heterogênea das amostras de câncer.
Embora não haja uma clara discriminação entre o grupo de câncer de próstata e pâncreas não sendo possível utilizar os nucleosídeos como um biomarcador específico de cada tipo de câncer, é possível classificar amostras de pacientes doentes ou saudáveis.
As amostras de câncer se encontram distribuídas de forma heterogênea independentemente do tipo de câncer. Esse comportamento pode estar relacionado com o grau ou estágio do câncer, presença de outras doenças no mesmo paciente, influência do gênero no caso do câncer de pâncreas e idade no caso de ambos os tipos de câncer. Estudos futuros inserindo essas características podem ajudar a refinar o modelo estatístico e aumentar o nível de acerto do modelo.
CONCLUSÃO
Para a quantificação dos nucleosídeos foi otimizado um método de análise por HPLC-MS/MS com fase móvel aquosa composta de 0,1 % (v/v) de ácido fórmico e a fase móvel orgânica (B) com 0,1% (v/v) de ácido fórmico em acetonitrila, utilizando eluição com gradiente de 5% de B até 4 minutos, aumento de 70% de B em 5 minutos, 60% de B até 6 minutos e 5% de B até 8 minutos.
A amostra foi purificada a partir da otimização do método de clean up que teve como princípio a precipitação prévia das proteínas do soro sanguíneo com solvente orgânico, sem extração por fase sólida (SPE) utilizando acetona gelada como agente de precipitação. Nesse processo, a citidina não apresentou recuperação adequada (acima de 50%) e, portanto, não foram continuadas as análises com esse nucleosídeos.
O nucleosídeo timidina não apresentou sinal detectável em nenhuma das amostras de saudáveis ou doentes (abaixo do limite de detecção) e os nucleosídeos adenosina, 2- deoxiadenosina e inosina, apresentaram sinais abaixo do LQ, inviabilizando a quantificação em amostras reais. Para os demais nucleosídeos (uridina, 5-metiluridina, guanosina e xantosina) foi realizado o processo de validação, apresentando linearidade, precisão e exatidão de acordo com o órgão legislador.
Ao avaliar as concentrações dos nucleosídeos no soro sanguíneo de indivíduos saudáveis e com câncer (próstata e pâncreas), foi possível predizer, através do segundo modelo proposto da regressão logística e da curva das características de operação do receptor (ROC), 79,5% dos casos de câncer de próstata e câncer de pâncreas corretamente, sendo que a área sobre a curva ROC foi de 0,680. A diferença nas concentrações dos analitos 5- metiluridina, uridina e guanosina foram capazes de explicar 79,48% da variabilidade dos grupos.
Ao avaliar os nucleosídeos em uma determinada população através da diferenciação entre os estados patológicos (doentes) e normais (saudáveis), foi possível observar as discriminações do grupo saudável em relação aos doentes, com maiores medidas de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia em relação aos métodos usualmente utilizados no diagnóstico de câncer de pâncreas (CA 19.9) e próstata (PSAt).
A discriminação entre os dois tipos de câncer (próstata e pâncreas) não foi aparente. Embora não seja observada uma discriminação distinta entre o grupo câncer de próstata e
pâncreas como também um biomarcador específico de cada tipo de câncer, foi possível classificar as amostras dos indivíduos com câncer e saudáveis, sendo possível utilizar a quantificação dos nucleosídeos no soro sanguíneo no acompanhamento das terapias e intervenções realizadas, além de auxiliar nos exames rotineiramente utilizados, de forma a evitar resultados falso-positivo ou falso negativo.
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