AU CARAVANSERAIL D'EZVAZAN

Para investigar a possibilidade de que o efeito do SIH estivesse relacionado com o surgimento de um novo mecanismo de nitrosação de DAF2, foi investigado o mecanismo de formação de DAFT na presença do quelante SIH. Para isso, foram utilizadas abordagens experimentais semelhantes às descritas e discutidas na parte 1.

Primeiramente, foi investigado se a formação de formação de DAFT na presença de SIH era dependente de superóxido. Para isso, células previamente tratadas com PEG-SOD (5µg/mL) por 24 horas foram coletadas e tratadas com DAF2-DA. A atividade dismutásica do extrato celular por mg de proteína total, medida pela inibição de redução de citocromo c férrico pelo sistema xantina/XO, aumentou 3,2 vezes, confirmando a eficácia do tratamento. Posteriormente, experimentos protocolares de formação de DAFT foram conduzidos na presença e ausência de SIH. Na figura 20 é possível observar que o aumento da atividade de SOD inibe completamente a formação de DAFT na presença e na ausência de SIH, revelando que mesmo na presença do quelante o processo de formação de DAFT depende da concentração de superóxido intracelular. Porém, por si só, esta observação não é definitiva, pois o processo poderia ser dependente de O2•¯ e ainda assim ser diferente dos mecanismos de nitrosação ou nitrosilação oxidativa.

Figura 20 – Influência do SIH na formação de DAFT em células tratadas com PEG-SOD por 24 horas. A eficiência do tratamento foi confirmada medindo o aumento da atividade da enzima pela inibição da redução de citrocomo C por superóxido gerado pelo sistema Xantina/ Xantina-Oxidase. As células tratadas com PEG-SOD foram coletadas e tratadas com DAF-2DA. As suspensões celulares tratadas com DAF-2DA forma expostas à •NO na presença e na ausência do quelante SIH e a fluorescência foi acompanhada em função do tempo. λex. 495nm; λem. 520nm.

Como a formação de O2•¯ depende de O2, alguns ensaios em condições desoxigenadas foram conduzidos. Como observado para situação na ausência de

SIH (repetida aqui), desoxigenação elimina a formação de DAFT na ausência de SIH e diminui drasticamente a velocidade de formação de DAFT na presença de SIH, sugerindo participação de O2•¯ mesmo na presença de SIH.

Porém, fica evidente que SIH parece acelerar a formação de DAFT mesmo em condições de dexoxigenação. O quociente de aceleração pelo SIH, medido pela razão entre a velocidade da amostra contendo e SIH e a amostra sem SIH, é bem inferior nesta situação. Nos dois casos, na presença e na ausência de SIH, é possível que ainda exista uma pequena parcela do gás dissolvido, apesar do esforço para remover O2, o que resultaria na produção de superóxido e explicaria a aceleração da formação de DAFT na presença de SIH. Entretanto, não pode ser descartada totalmente a possibilidade de que SIH introduz um novo mecanismo de nitrosação de DAF2 em condições desoxigenadas e que LIP inibe este mecanismo também. Neste caso, esperar-se-ia que o mecanismo envolvendo SIH ou LIP fosse independente de O2 e de O2•¯ e que respondesse de forma diferente a reagentes que interferem nos mecanismos de nitrosação e nitrosilação oxidativa que dependem de O2•¯.

Mas, considerando que a reatividade de •NO é restrita a radicais e metais, a hipótese mais provável é a da existência de oxigênio e superóxido residual nestes experimentos.

Figura 21 – Efeito do SIH na formação de DAFT em condições de hipóxia.

Células tratadas com DAF2-DA foram suspensas em tampão de trabalho previamente desoxigenado e foram expostas a •NO na presença e ausência de SIH. As medidas foram conduzidas em uma cubeta fechada para impedir entrada de O2.

Os quocientes de aceleração de SIH foram calculados a partir da razão entre os coeficientes angulares das amostras contendo SIH e a amostra sem SIH para as duas condições de oxigenação. λex. 495nm; λem. 520nm.

Com esta suposição e com o objetivo específico de investigar se os processos de formação de DAFT na presença do quelante SIH são os mesmos do que na sua ausência, em seguida, foi avaliado se espécies antioxidantes, como ácido ascórbico e ácido úrico, inibem o processo de nitrosação do DAF2 na presença de SIH, da mesma forma como inibem na ausência de SIH (Figura 12). Na figura 22 estão apresentados os resultados de ensaios que foram realizados na presença de ácido úrico, hexacianoferrato (FCN) e ácido ascórbico. Todos os compostos inibiram completamente a formação de DAFT independentemente da presença do quelante SIH, o que reforça a noção de que mesmo na presença do quelante, os mecanismos de nitrosação e nitrosilação oxidativa são os dois únicos processos que governam a formação de DAFT em células RAW 264.7.

Figura 22 – Efeito de SIH na presença de antioxidantes. Células tratadas com DAF2-DA foram expostas à •NO na presença de diferentes antioxidantes que reagem com derivados de peroxinitrito rapidamente na ausência e na presença de SIH. Os valores representam as médias de 3 medidas ±D.P. λex. 495nm; λem. 520nm.

FCN, ácido úrico152 e ascorbato, não reagem diretamente com peroxinitrito rapidamente, de forma que os efeitos observados na formação de DAFT somente podem ser consequência de reações com os radicais derivados de peroxinitrito que estimulam a formação de DAFT (NO2•, CO3•¯, •OH). Além disso, nestes

experimentos, apenas ascorbato estava presente no interior celular devido ao tratamento das células por 3 horas antes dos experimentos, conforme descrito na parte 1. FCN e ácido úrico foram introduzidos no tampão de trabalho imediatamente antes dos ensaios, portanto, ficam retidos no espaço extracelular, sugerindo que a espécie derivada de peroxinitrito mais relevante para a formação de DAFT é difusível, novamente apontando para NO2•, assim como tinha sido observado anteriormente e confirmado aqui, para a situação na ausência do quelante.

Finalmente foi avaliado se a produção líquida de radicais derivados de peroxinitrito intracelular devido à presença de CO2111; 112; 113 poderia afetar a taxa de formação de DAFT na presença de SIH. Observa-se que não houve aumento na taxa de formação de DAFT na amostra preparada em tampão equilibrado com 25mM de bicarbonato e sper/NO 15 M quando comparado com o controle, o que difere do resultado obtido anteriormente. Mas, curiosamente, a taxa de formação de DAFT na presença de SIH aumenta na presença de CO2 adicional (figura 23).

Figura 23 – Influência do aumento da concentração de CO2 na taxa de formação de DAFT na presença e na ausência de SIH. Células tratadas com DAF2- DA foram suspensas em tampão PBS contendo 25mM de bicarbonato de sódio e expostas a sper/NO 15µM. Nas amostras contendo SIH a concentração do quelante, adicionado 5 minutos antes da adição de sper/NO, é de 100µM. Os valores representam as médias de 3 amostras ±D.P. As médias não apresentaram diferenças significativas para as amostras sem SIH. As médias das amostras contendo SIH são significativamente diferentes entre si (p <0,05). λex. 495nm; λem. 520nm.

4.2.3. Hipóteses para a aceleração de formação de DAFT na presença de