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O aumento global do número de aplicações envolvendo pDNA na terapêutica criou a necessidade de grandes quantidades de moléculas altamente estáveis com diferentes graus de pureza. Um dos principais obstáculos durante os estágios de

desenvolvimento de uma nova vacina de DNA envolve a luta contra uma vasta gama de eventos que afetam a estabilidade do pDNA, como manter a integridade durante o processamento e purificação, a estabilidade farmacocinética em humanos ou animais e a estabilidade como fármaco durante o armazenamento e transporte (OLIVEIRA et al., 2009).

Após o processo de purificação, o pDNA precisa ser administrado às células alvo. O percurso biológico do pDNA ao núcleo celular é dificultado por várias barreiras físicas, incluindo a membrana citoplasmática, a rede de proteínas do citoesqueleto, organelas que sobrecarregam o citoplasma e a membrana nuclear (FAUREZ et al., 2010). Além disso, a degradação de pDNA por exo/endonucleases intra e extracelular constitui uma das principais barreiras à expressão gênica eficiente (LECHARDEUR et al., 1999; RIBEIRO et al., 2004), pois somente pequenas quantidades de pDNA (0,1%) que entram nas células alcançam o núcleo (FAUREZ et al., 2010).

O tipo e organização geral dos elementos genéticos presentes nos pDNA têm impacto direto não apenas na sua produção em massa, mas também na sua estabilidade, eficácia e, em última análise, sua aprovação clínica em terapia gênica e vacinas de DNA. (ŠIMČÍKOVÁ et al., 2015). O desenho de um vetor plasmídico deve levar em consideração aspectos como a estabilidade de pDNA in vivo, o perfil de expressão do transgene, o impacto das sequências procarióticas e a resposta do sistema imunitário do hospedeiro ao vetor (PRAZERES; MONTEIRO, 2014).

A remoção de sequências não essências aos pDNA formadoras de estruturas secundárias (por exemplo, sequências ricas em homopurina e cruciformes) do esqueleto do pDNA (RIBEIRO et al., 2004) e a coadministração de inibidores de nucleases como ácido aurintricarboxílico (WALTHER et al., 2005) e DMI-2 (ROSS et

al., 1998) foram definidos como uma possibilidade de melhorar a resistência de

pDNA às nucleases. Os pDNAs contendo repetições diretas e invertidas, sequências de inserção e regiões semelhantes ao DNA genômico podem sofrer rearranjos genéticos, como deleções, duplicações, reversões, translocações e inserções (PRATHER et al., 2006; RIBEIRO et al., 2008). Estes rearranjos podem afetar tanto a produção de pDNA em E. coli como a eficiente expressão do transgene em células eucarióticas. Estas e outras regiões instáveis devem ser removidas do vetor ou pelo

menos modificadas sempre que possível, uma vez que a remoção de sequências não essenciais do plasmídeo reduz o tamanho do mesmo, diminuindo assim as regiões susceptíveis do pDNA ao ataque de nucleases e aumentando sua capacidade molecular como vetor em terapia gênica (OLIVEIRA et al., 2009a; OLIVEIRA et al., 2009b).

A expressão gênica eficiente só é conseguida se a maioria das moléculas de pDNA atingirem o núcleo de forma íntegra e preferencialmente na isoforma super- enrolada. A maioria das abordagens frequentes para promover a captação de pDNA envolvem proteção contra a degradação de nucleases utilizando adjuvantes tais como polímeros catiônicos, lipídeos catiônicos ou uma mistura de ambos (RIBEIRO

et al., 2004). De acordo com Zhang (1996), a instabilidade é a tendência das células

transformadas perderem suas propriedades de engenharia molecular por causa de mudanças ou perdas do plasmídeo, assim, Oliveira e colaboradores (2009), afirmam que todos os eventos que levam a instabilidade podem ser contornados pela concepção eficiente e racional a priori da estrutura do plasmídeo.

Os pDNAs para a terapia gênica são acometidos com algumas limitações inerentes notáveis. A maioria das preparações de pDNA contém variantes topológicas do plasmídeo, incluindo a super-enrolada (a topologia preferida para uso como vetor), e as formas circular abertas e linear, não desejadas da molécula (HARDEE et al., 2017). Como já mencionado, os plasmídeos são geralmente ineficientes no fornecimento de suas cargas úteis em comparação com os vírus, exigindo veículos, forças físicas ou modificações especializadas para captação e localização nuclear, portanto, barreiras para a libertação eficaz de pDNA precisam ser superadas. Estas barreiras (figura 7) incluem (a) degradação do pDNA no espaço extracelular, (b) internalização do plasmídeo por endossoma, (c) atravessar a membrana celular pelos poros membranares, (d) tráfico lisossomal e subsequente degradação, (e) fuga de lisossoma para o citoplasma e sobrevivência à degradação por nucleases citosólicas , (f) trafegar o citoplasma sobrecarregado e (g) atravessar a membrana nuclear e proporcionar a transcrição de genes (PRAZERES; MONTEIRO, 2014).

Figura 7: Barreiras extra e intracelulares à transferência de genes baseada em plasmídeos ao longo do percuso biológico do plasmídeo ao núcleo. Adaptado e traduzido de (PRAZERES; MONTEIRO, 2014).

Devido à maior segurança em relação aos vetores virais, os pDNAs permitiram um número cada vez maior de triagens clínicas. Em comparação aos vetores virais, os pDNAs são mais fáceis e mais baratos de produzir, transportar e armazenar, além disso a natureza modular dos pDNAs permite a clonagem molecular simples, tornando-os fáceis de manipular e de design para uso terapêutico. As vantagens importantes de vetores de DNA não virais sobre vetores virais e vetores baseados em RNA têm obrigado pesquisadores a trabalhar para ultrapassar as barreiras que impedem a aplicação de pDNA em terapia gênica, uma vez que esses vetores possuem inúmeras vantagens em relação aos virais (HARDEE et al., 2017).

Para as aplicações in vivo, as propriedades físico-químicas dos vetores que afetam a sua estabilidade, bem como as interações com os componentes sistêmicos extracelulares e o sistema imunitário são também de importância significativa. No entanto, qualquer um ou todos estes processos podem representar um obstáculo significativo à transfecção eficiente. Em geral, um vetor ideal deve ser capaz de compactar o DNA, aumentar a sua entrada na célula alvo específica, auxiliar na superação de várias barreiras intracelulares, conferir resistência ao ataque de nucleases e apresentar baixa toxicidade (ROTH e SUNDARAM, 2004). Visto a necessidade de manter a integridade e estabilidade dos pDNAs para sucesso como molécula terapêutica em terapia gênica e vacinas de DNA, esse estudo tem o objetivo de avaliar a estabilidade físico-química e biológica de pDNAs com pontencial terapêutico frente a diferentes temperaturas durante armazenamento

prolongado, esboçar o comportamento da molécula plasmídica, quando administrado intravenosamente, frente ao ataque de nucleases e ressaltar a eficiência de transformação desses plasmídeos após a exposição dos mesmos às situações adversas submetidas, uma vez que é de extrema importância manter a taxa de transfecção dessas moléculas para eficácia das vacinas de DNA.