Approximation – Algorithm

A quantificação dos compostos de interesse foi realizada utilizando as equações de reta obtidas através da avaliação da linearidade do método. A análise cromatográfica foi realizada utilizando a fração AcOEt de A. occidentale numa concentração de 2 mg/mL. As áreas sob a curva dos picos de interesse foram obtidas para a realização dos cálculos.

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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO

Ao se realizar uma análise cromatográfica com qualquer amostra, é necessário observar a natureza dos analitos para que possa ser selecionada uma fase móvel adequada. É mostrado na literatura que a fração AcOEt do extrato acetona:água das cascas do caule de A. occidentale apresenta taninos em sua constituição química (MOTA et al, 1985), além de outros compostos. Fujita (2008) relata a presença de esteroides, flavonoides, catequinas, fenóis, taninos, gomas, resinas, material corante e saponinas nas folhas e cascas do caule desta planta.

É sabido que o uso de uma fase móvel ácida é satisfatório quando se tem analitos com caráter ácido, pois resulta em uma boa seletividade e simetria dos picos do cromatograma. Isso ocorre porque o pH da fase móvel afeta o grau de dissociação dos compostos ácidos e básicos da amostra e os grupos silanois livres presentes na superfície da fase estacionária. É comum a utilização de ácido acético, fosfórico ou trifluoroacético para controlar o grau de interação dos analitos com a fase estacionária e tornar os picos mais simétricos (KROMIDAS, 2005). Para a realização das análises, utilizou-se ácido acético 0,3% (fase aquosa), com pH em torno de 2,8.

Para se analisar a polaridade dos compostos presentes na fração AcOEt de A. occidentale, foi realizado um gradiente exploratório como ponto de partida para o desenvolvimento de um método cromatográfico adequado (ver gradiente 1 da Tabela 1 em Materiais e Métodos).

Sabe-se que a separação dos compostos resulta de um equilíbrio de distribuição do soluto entre a fase estacionária, empacotada no interior de uma coluna, e uma fase móvel (LEITE, 2008). No cromatograma resultante da análise com o gradiente exploratório, é possível observar que há uma predominância de picos no início do cromatograma, indicando que a maioria dos compostos eluem com maior facilidade quando se tem uma maior proporção da Fase A, que tem um caráter predominantemente mais polar do que a Fase B. Com o decorrer da análise, a proporção de Fase B vai aumentando, contribuindo para a eluição de compostos mais apolares. Nesse estágio da análise, observa-se a escassez de picos no

49 cromatograma, aparecendo 01 (um) composto com tempo de retenção de, aproximadamente, 53 minutos. É mostrado, na Figura 3, o cromatograma obtido a partir da análise realizada com o gradiente exploratório.

Figura 3 – Cromatograma da fração AcOEt de A. occidentale obtido após

análise com gradiente exploratório (0 – 60 minutos; 5 – 100% Fase B).

FE: coluna C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 µm); FM: gradiente exploratório ACN:ácido acético 0,3 %; fluxo 1,0 mL/min; detecção: 280 nm. Equipamento Shimadzu®.

A partir do resultado obtido, foram realizados ajustes no gradiente cromatográfico, procurando diminuir a proporção de Fase B durante a corrida cromatográfica. Uma maior proporção de Fase A possibilita que os compostos interajam por mais tempo com a fase estacionária, permitindo uma melhor separação. Alguns gradientes cromatográficos foram testados (ver Tabela 1 em Materiais e Métodos) e, a partir destas análises, foi possível estabelecer as condições adequadas para a obtenção de um cromatograma com a melhor resolução de picos, nas quais fosse possível identificar e quantificar os compostos.

De acordo com o que foi discutido no parágrafo anterior, o método selecionado apresentou uma menor proporção de fase orgânica (Fase B) durante a corrida cromatográfica. O gradiente cromatográfico estabelecido se inicia com 7% de Fase B, chegando a 12% em 18 minutos em um gradiente linear; a proporção de fase móvel se mantém então constante (isocrática), com 12% de Fase B, até os 35 minutos de análise. A partir de então, a proporção de fase B diminui novamente para 7% no tempo de 36 minutos, permanecendo nessa proporção até 45 minutos, com o

50 objetivo de condicionar a coluna para uma nova injeção de amostra. O gradiente cromatográfico está apresentado na Tabela 4. O fluxo da fase móvel foi de 0,8 mL/min, a coluna foi mantida à temperatura de 30 ºC, sendo a leitura realizada em um comprimento de onda de 280 nm.

Tabela 4 – Gradiente cromatográfico selecionado para a realização das análises com a

Fração AcOEt de A. occidentale.

Tempo (minutos) Fase A (%) Fase B (%) Eluição

0 – 18 93  88 7  12 Gradiente linear

18 – 35 88 12 Isocrático

36 – 45 93  88 12  7 Gradiente linear

Essas condições foram reproduzidas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de arranjo de fotodiodos (DAD). Esse tipo de detector possibilita a obtenção de um espectro para cada tempo de retenção, permitindo não só uma verificação mais completa com relação a pureza do pico cromatográfico e consequentemente da eficiência da separação, como também uma análise rápida, pois em uma única eluição todos os cromóforos podem ser observados (LOBINSKI; MARCZENKO, 1992; JONES, 1985).

Os picos do cromatograma obtido apresentaram boa separação e tempo de eluição satisfatório, considerando que a amostra se trata de uma mistura complexa. Portanto, o método é adequado para a análise da fração AcOEt das cascas do caule de A. occidentale. O cromatograma obtido com as condições otimizadas do método é mostrado na Figura 4.

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Figura 4 – Cromatograma obtido através da análise da fração AcOEt do

extrato acetona:água de A. occidentale nas condições otimizadas do método analítico.

FE: coluna C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 µm); FM: gradiente selecionado; fluxo 0,8 mL/min; detecção: 280 nm. Equipamento Shimadzu®.

5.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS

Para realizar a posterior identificação dos compostos, cada pico foi analisado quanto ao seu espectro de absorção no UV, sendo possível determinar os comprimentos de onda em que ocorre a maior absorção de energia pelo composto durante a análise. São indicados, na Figura 5, o Tr e as bandas de absorção (nm) das substâncias presentes na fração AcOEt de A. occidentale, além do gráfico do espectro de absorção UV. Para uma melhor visualização dos picos de menor intensidade, o cromatograma foi ampliado. Para a obtenção das bandas de absorção UV correspondentes a cada composto, foi avaliado o intervalo de comprimento de onda de 200 a 400 nm.

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Figura 5 – Cromatograma (ampliado) obtido através da análise da Fração AcOEt de A. occidentale e espectros de absorção UV e Tempos de Retenção (Tr) das substâncias

presentes.

Pico Tr (min) Máximos de absorção (nm) Espectro de absorção 1 6,80 222 e 271 2 12,57 215, 259 e 293 3 14,24 214, 270 e 372 4 15,91 214 e 269 A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm]

53 5 17,60 214 e 274 6 19,85 211 e 278 7 26,19 214 e 274 8 28,44 215 e 277 9 30,95 216 e 274

Observou-se que o comprimento de onda em torno de 215 nm seria bom para a identificação dos compostos, mas por ser muito inespecífico, permite a identificação de muitas impurezas, tornando difícil a visualização de picos de interesse no cromatograma. Assim, foi escolhido o comprimento de onda de 280 nm, que se mostrou ser mais adequado.

Após os resultados obtidos, foram realizadas análises com os padrões de referência, utilizando o gradiente de eluição escolhido, com o objetivo de tentar identificar alguns dos compostos presentes na fração AcOEt de A. occidentale. Dentre os padrões analisados, ácido gálico, catequina, epicatequina e epigalocatequina se assemelharam a picos existentes no cromatograma da análise da fração AcOEt de A. occidentale, quando observados os seus tempos de retenção

A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia A b s o rb â n c ia Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm] Comprimento de onda [nm]

54 e espectros de absorção UV. Na Figura 6 são mostradas as estruturas químicas dos padrões, acompanhadas dos respectivos espectros de absorção na região do UV, obtidos através da injeção desses compostos isolados, utilizando o gradiente cromatográfico selecionado.

No cromatograma referente à análise da fração AcOEt de A. occidentale (Figura 5), os picos sugeridos como sendo ácido gálico, catequina, epicatequina e epigalocatequina estão indicados como 1, 5, 8 e 9. Para tentar confirmar a presença desses compostos, foi realizada a coinjeção da amostra estudada com os padrões indicados.

Os cromatogramas obtidos pela análise com a fração AcOEt de A. occidentale, e as coinjeções com ácido gálico, catequina, epicatequina e epigalocatequina são mostrados na Figura 7. No cromatograma referente à análise da coinjeção da amostra com ácido gálico, percebe-se que não houve a detecção de um novo composto e o espectro de absorção do pico com Tr = 6,71 minutos não mudou, quando comparado ao correspondente no cromatograma resultante da análise da fração AcOEt de A. occidentale. O mesmo aconteceu com relação aos compostos com Tr igual a 19,48; 28,39 e 31,80 minutos, o que sugere que os picos são correspondentes à catequina, epicatequina e epigalocatequina, respectivamente.

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56 AcOEt de A. occidentale (A) e (B), e as coinjeções com ácido gálico (1), catequina (2), epicatequina (3) e epigalocatequina (4).

Nota: (B), (2), (3) e (4) apresentam cromatogramas ampliados.

As áreas dos picos obtidos após a coinjeção foram então comparadas com as áreas obtidas a partir da análise da fração AcOEt de A. occidentale, determinando assim se houve aumento nesse valor. O aumento da área do pico é sugestivo que uma maior concentração da amostra foi detectada, indicando que o padrão adicionado trata-se de um dos compostos já presentes.

57 indicados na Tabela 5.

Tabela 5 – Áreas dos picos de interesse, obtidas pelo cromatograma resultante da

análise da Fração AcOEt das cascas do caule de A. occidentale comparado às áreas dos picos de interesse no cromatograma obtidas através dos cromatogramas resultantes das análises de coinjeção com ácido gálico, catequina, epicatequina e epigalocatequina.

Resultado da análise com a

fração AcOEt de A. occidentale. Resultado das análises de coinjeção

Tr (min) Área [mAU.s] Coinjeção com: Tr

(min) Área [mAU.s]

6,79 19837,2 Ácido gálico 6,72 26015,2

19,83 167,1 Catequina 19,48 540,8

28,44 1447 Epicatequina 28,36 3293

30,96 2918 Epigalocatequina 31,8 11233,5

Comparando os resultados obtidos, é possível visualizar claramente que houve o aumento na área de todos os picos sugestivos das substâncias padrões. Assim, esse estudo sugere que a Fração AcOEt das cascas do caule de A. occidentale apresenta em sua constituição química ácido gálico, catequina, epicatequina e epigalocatequina, dentre outros compostos.

Esses resultados corroboram com os dados encontrados na literatura, que indicam um alto teor de compostos fenólicos na casca do caule de A. occidentale (CHAVES et al, 2010). Fujita (2008) também já havia relatado a presença de flavonoides, catequinas e taninos, além de outros compostos (FUJITA, 2008). A presença de taninos na fração AcOEt das cascas do caule de A. occidentale já havia sido evidenciada por Mota et al (1985).