Approches expérimentales pour l’identification de cibles

La découverte de nouveaux sRNAs a occasionné de nombreux questionnements sur leurs rôles fonctionnels et sur leur intégration dans les réseaux de régulation nécessaire pour le maintien de la physiologie bactérienne. Dans le cas des sRNAs cis-antisens, l’identification des cibles va être relativement simple, dans la mesure où ces sRNAs sont transcrits sur le brin reverse des gènes qu’ils régulent. Les cibles des sRNAs trans-antisens vont, quant à elles, être plus compliquées à mettre en évidence. Les méthodes d’identification des cibles de ces sRNAs vont être assez nombreuses, et vont regrouper entre autres, des analyses à grande échelle bioinformatiques, l’utilisation de microrrays, des analyses de protéomique, ainsi que des approches biochimiques de capture d’affinité (J. Vogel & Wagner, 2007 ; Sharma & Vogel, 2009). L’identification de gènes candidats peut également se faire via l’étude des gènes différentiellement exprimés lors de la délétion ou de la (sur)expression d’un sRNA (Papenfort et al., 2006 ; A. A. Rasmussen et al., 2005).

Néanmoins, l’inconvénient de ces approches reste la difficulté de distinguer les cibles primaires (qui vont interagir physiquement avec le sRNAs) des cibles secondaires (qui n’interagissent pas directement avec le sRNA mais qui sont situées en aval d’une cascade de régulation impliquant le sRNA). En tout état de cause, les méthodes de prédiction de cibles pour les sRNAs imposent une validation a posteriori des candidats.

4.2.8.1 Approches génétiques

Une approche assez classique va consister à construire des bactéries mutantes qui vont être modifiées spécifiquement pour la fonction étudiée. On peut par exemple citer des approches basées sur l’utilisation d’un bactériophage (λ placMu) aléatoirement inséré dans le génome de la bactérie avec un gène rapporteur (souvent lacZ) dont les promoteurs et signaux d’initiation de la traduction ont été enlevés de la séquence. L’intégration de ce phage dans la bonne orientation et dans le bon cadre de lecture, va permettre d’obtenir un gène de fusion où l’expression de lacZ va être placée sous la dépendance du promoteur et site d’initiation de la traduction du gène cible.

Ainsi, le niveau d’expression des protéines obtenues, issues de la fusion du gène cible et de la protéine β -D-galactosidase, est analysé par suivi colorimétrique à l’aide d’un substrat de l’enzyme¹⁴qui va générer un produit de réaction coloré. Si la souche contient un sRNA inductible, les gènes de fusion pourront donc soit être surexprimés (colonies bleues) soit sous-exprimés (colonies blanches). Ce type d’approche ne permettra de mettre en évidence qu’une régulation exercée au niveau de la région 5’UTR du gène cible, dans la mesure où le sRNA cible la région initiatrice de la traduction. Les gènes cibles vont par la suite pouvoir être identifiés par clonage et séquençage de la région correspondante (Altuvia et al., 1997).

4.2.8.2 Approches microarray

L’identification des cibles des sRNAs peut être réalisée via l’utilisation de microarrays. Les méthodes de microarray vont permettre de comparer les profils d’expression des gènes de souches caractérisées par des niveaux d’expression différents d’un sRNA étudié, à l’aide du marquage fluorescent des pools d’ADNc des ARNm. Ces approches utilisent généralement, une souche non modifiée WT¹⁵, une souche dont le sRNA aura été supprimé et une souche surexprimant le sRNA (Bernstein, Khodursky, Lin, Lin-Chao, & Cohen, 2002). Néanmoins, ces méthodes ne permettront

14. 4-chloro-3-indolyl-β -D-galactoside (X-Gal) 15. Wild type

pas de mettre en évidence les effets de régulation de la traduction médiés par certains sRNAs (seul le messager va être considéré).

4.2.8.3 Approches basées sur l’analyse protéomique

Les approches de protéomique quantitative peuvent également être utilisées afin de comparer les profils d’expression des protéines en fonction de la présence ou de l’absence d’expression d’un sRNA donné. Ainsi, leur avantage réside dans leur capacité à mettre en évidence l’impact des sRNAs au niveau de la régulation de la traduction. Néanmoins, elles présentent l’inconvénient de nécessiter des étapes de préparation difficiles à mettre en œuvre. Ces méthodes peinent à identifier les protéines peu solubles, telles que les protéines membranaires, elles ne vont finalement permettre de visualiser qu’environ 10% de l’ensemble des protéines (Pfeiffer et al., 2007).

4.2.8.4 Capture par chromatographie d’affinité

L’inconvénient majeur des approches de détection des cibles des sRNA est la production d’un taux élevé de faux-positifs. Les études de chromatographie d’affinité vont permettre de réduire ce biais en se focalisant sur les cibles primaires (voirfig.4.13). Ainsi, les sRNAs vont être liés de manière covalente au niveau d’une colonne d’élution afin de capturer les ARNm ou les protéines cibles (dans la cas d’interaction sRNA-protéines) (Hovhannisyan & Carstens, 2009 ; Chant & Summers, 2007). Certains sRNAs nécessitent également la présence de facteurs auxiliaires, notamment celle de la chaperonne Hfq. L’intérêt de ces méthodes réside dans la possibilité d’inclure ces facteurs au cours de l’immobilisation des sRNAs au niveau de la colonne (Antal, Bordeau, Douchin, & Felden, 2005 ; M. J. Vogel, Peric-Hupkes, & van Steensel, 2007 ; Saliba, C Santos, & Vogel, 2017). Ces approches peuvent également donner lieu à des interactions non-spécifiques (Hovhannisyan & Carstens, 2009 ; Chant & Summers, 2007).

ARNm

2. Purification des

complexes

4'. Séparation

sur gel

d'électrophorèse

1. Extraction des

complexes sRNA‐cible

3. Elution

des

cibles

4. Convertion en ADNc

+

marquage fluorescent

5. Hybridation

sur

microarrays

4'. Identification des protéines

par spectrométrie de masse

Identification de

la protéine cible

Identification de

l'ARNm cible

FIGURE4.13: Identification des cibles des sRNAs. Exemple de stratégie d’identification combinée des complexes sRNA-mRNA et sRNAs-protéines.

4.2.8.5 Approches basées sur l’immunoprécipitation (RIP16)

Ces approches vont permettre d’identifier la présence d’interactions ARN-protéine à l’aide d’une étape d’immunoprécipitation du complexe formé à l’aide d’anticorps spécifiques de la protéine d’intérêt. Après élimination des ARNs non liés par une étape d’électrophorèse, le complexe est soumis à une digestion RNAse. L’ARN, protégé de la RNAse par la liaison de la protéine, est finalement extrait et reverse transcrit en ADNc. Cet ADNc peut être, par la suite, analysé par des approches microarray, RIP-chip (Penalva, Tenenbaum, & Keene, 2004), ou par des approches de séquençage RNA-seq, RIP-seq (J. Zhao et al., 2010).

4.2.8.6 Validation des cibles 4.2.8.6.1 Approches in vitro

La réalisation d’expériences de validation in vitro est requise afin de valider un mode d’action médié par les sRNAs. Il permet d’attester l’existence d’un mécanisme de régulation. Les mêmes stratégies vont pouvoir être utilisées pour les protéines et les messagers.

L’approche EMSA¹⁷(Morita, Maki, & Aiba, 2012) permet une visualisation du complexe mobilisant le sRNA et l’ARNm ou la protéine. L’utilisation de sondes chimiques ou enzymatiques en solution, va permettre de suivre l’appariement et les changements conformationnels opérés lors de la formation du duplex. Ce type d’approche permet également de mettre en évidence, la présence de molécules auxiliaires, nécessaires à l’établissement de l’interaction comme, par exemple, Hfq (Antal et al., 2005 ; Heidrich, Moll, & Brantl, 2007).

De même, la régulation de la traduction médiée par les sRNAs peut être mise en évidence par les approches de type ribosomal toeprint. Ces approches sont basées sur l’inhibition de l’élongation médiée par la reverse-transcriptase lorsque que les ribosomes sont recrutés sur l’ARNm. Ceci permet de mettre en évidence la formation des complexes d’initiation de la traduction in vitro en fonction de la présence ou de l’absence du sRNA (Fechter et al., 2009). De même, il va également être possible de cibler des structures secondaires d’ARN en solution à l’aide d’agents chimiques ou de nucléases (Chevalier, Geissmann, Helfer, & Romby, 2009).

4.2.8.6.2 Approches in vivo

La confirmation des mécanismes d’actions de ces sRNAs peut également être réalisée par des approches in vivo. La génération de mutations (ou d’indels) au niveau de la région d’interaction du côté du sRNA ou de l’ARNm, permet d’impacter négativement cette association (Boisset et al., 2007 ; Chabelskaya, Gaillot, & Felden, 2010). Réciproquement, l’introduction d’une mutation compensatoire de la première va permettre de rétablir l’interaction. Ceci constitue une étape de validation robuste de l’interaction sRNA-mRNA (Bouvier, Sharma, Mika, Nierhaus, & Vogel, 2008 ; Papenfort et al., 2008).