La technique d’incubation du tronc cérébral en entier sur une période de 24h fut développée afin d’avoir une diffusion complète des hormones à travers les tissus et ainsi s’assurer que tous les centres de contrôle respiratoire soient en constant contact avec les hormones au cours de la période d’incubation. De plus, procéder aux enregistrements sur 24h suivant la mise en bouteille nous a permis de confirmer la présences des récepteurs des corticostéroïdes et de l’hormone thyroïdienne dans le tronc cérébral ainsi qu’un effet génomique des hormones sur le remodelage du système nerveux central. Malgré l’utilisation selon nous justifiée de cette technique pour l’étude, nous aurions pu utiliser des approches alternatives dans le but de viser des zones précises responsables du contrôle respiratoire.
4.1 La méthode «Sheep-Dip»
La méthode de «Sheep-Dip» est une technique nouvelle dans le domaine de l’électrophysiologie respiratoire. Contrairement au procédé de base de l’enregistrement sur tronc cérébral isolé où la préparation est submergée dans un liquide céphalo-rachidien artificiel constamment renouvelé, la technique du «Sheep- Dip» consiste à installer le tronc cérébral verticalement dans la chambre d’enregistrement (Fig. 3.3). Au lieu de procéder à une immersion complète du tronc- cérébral, le liquide céphalo-rachidien coule constamment sur la préparation à partir du haut de la chambre. La préparation peut alors être plongée en partie dans une seconde chambre qui contient un liquide pouvant avoir plusieurs fonctions selon le type de procédure. Dans le cadre de la recherche de Duchcherer et son équipe (Duchcherer et al., 2013) le liquide était constitué d’une forte dose de Mg2+ et d’une
faible dose de Ca2+ afin de bloquer les synapses par une faible entrée de calcium et
ainsi inhiber l’activité d’une zone précise du tronc cérébrale. L’avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer une ablation chimique réversible qui réduit le risque de dommages aux axones. La technique du «Sheep-Dip» a bien sur ses avantages et désavantages. Contrairement aux micro-injections de drogues qui assurent un effet précis et une pénétration profonde de la drogue, il est impossible d’assurer une profondeur précise avec le «Sheep-Dip». Cependant, il permet une
application de la drogue sur une grande région de la préparation, ce qui est avantageux lorsqu’on étudie une voie neural avec plusieurs interactions où un blocage local pourrait être compensé par le reste du système neural relié à cette voie (Duchcherer et al., 2013).
Figure 3.3 : Technique d’enregistrement électrophysiologique «Sheep-Dip». Les neurogrammes représentent l’activité respiratoire fictive enregistrée à partir des nerfs crâniens Trijumeaux (V) et Facial (VII). Tiré de Duchcherer et al., 2013.
4.2 La technique «Split-bath»
La technique «Split-bath» est très similaire à la technique que nous avons utilisée dans les enregistrements électrophysiologiques sur tronc cérébral isolé. Cependant, la préparation n’est pas immergée en entier dans une même solution. Grâce à une membrane de plastique et de vaseline, une séparation de la chambre incluant le tronc cérébral peut être effectuée, ce qui permet d’irriguer chaque compartiment avec une solution de liquide céphalorachidien artificiel (LCRa) différente. Cette technique a été utilisée par Johnson et Mitchell (1998) avec une préparation de tortue où ils ont séparé le tronc cérébral et la moelle épinière (Fig. 3.4).
Figure 3.4 : Technique d’enregistrement électrophysiologique «Split-bath». La bande noire représente la barrière séparant la chambre d’enregistrement en deux compartiments non connectés. Tiré de Johnson et Mitchell, 1998
4.3 Liens potentiels avec notre protocole
Dans le cadre de l’étude de l’effet des hormones métamorphiques sur le développement du système de contrôle respiratoire, nous pourrions procéder à l’exposition de régions spécifiques du tronc cérébral aux hormones. Nous serions alors en mesure d’approfondir les connaissances sur l’emplacement des différents récepteurs dans le tronc cérébral. En accord avec nos observations, des études ont déjà démontré que les récepteurs thyroïdiens ainsi que les récepteurs glucocorticoïdes et minéralocorticoïdes sont présents dans les tissus du système nerveux central (Brown et Cai, 2007; Arriza et al., 1988), mais leur emplacement exact dans le tronc cérébral reste à confirmer. En plus d’aider à la localisation des récepteurs, la combinaison des différentes techniques d’enregistrement électrophysiologique élargirait notre savoir sur l’interaction des hormones métamorphiques avec d’autres voies de signalisation dans le remodelage du système de contrôle respiratoire. Le rhombomère 5 contenant le générateur de rythme pulmonaire serait une cible de choix dans cette pratique. Avec la technique du «Split-bath», il pourrait être très intéressant d’effectuer simultanément un blocage du rhombomère 7 contenant le générateur de rythme branchial inhibiteur de la respiration pulmonaire ainsi qu’une activation du rhombomère 5 par les hormones métamorphiques. Cette combinaison
pourrait grandement améliorer la réponse du tronc cérébral puisque nous accélérerions le processus de désinhibition développementale. La technique du «Sheep-Dip» pourrait aussi être utilisée dans la détection des centres sensibles à l’O2
et au CO2 ainsi que leur possible déplacement au cours du développement de
l’amphibien (Voir Chap. I, Section 3). Il est cependant important de considérer la raison principale pour laquelle nous avons procédé à l’incubation en bouteille sur 24h. L’irrigation constante, proposée dans la technique du «Sheep-dip» et du «Split- bath» demande des quantités importantes de LCRa et surtout une alimentation continue en gaz. Ce facteur peut être limitant, d’où notre utilisation de bouteilles fermées hermétiquement. Malgré tout, si nous ne considérons pas les inconvénients techniques de l’irrigation continue, un croisement des manipulations proposées ci- dessus avec notre protocole ouvrirait des portes sur la compréhension anatomique des zones responsables du contrôle respiratoire ainsi que leurs interactions. Finalement, comme il a été mentionné précédemment (Chapitre III, Section 4.1), la micro- injection d’hormones dans une région spécifique assurerait une diffusion profonde du produit dans les tissus ainsi qu’une certitude que la zone voulue soit en contact avec les hormones (Duchcherer et al., 2013). Cette technique demanderait cependant une répétition dans le processus d’injection afin d’avoir une réponse à l’exposition chronique (24h) aux hormones, ce qui nous porte à croire que l’incubation dans le liquide céphalorachidien reste à ce jour une technique très fiable pour répondre à nos questions.