L’avènement de la biologie moléculaire et le développement de techniques de fragment d’ADN permettant d’extraire l’ADN (ou l’ARN) à partir de la matrice fromagère (Jany et Barbier, 2008), a permisde produire une empreinte génomique à partir d’un produit PCR. Elle donne alors une image globale de la structure génétique de la communauté bactérienne. Les gènes cibles les plus utilisés lors de l’analyse de communautés microbiennes sont ceux de l’opéron ribosomal, particulièrement l’ARN 16S, ainsi que la séquence d’ADN séparant les gènes de l’ARN ribosomal 16S et 23S. Les propriétés phylogénétiques du 16S ainsi que le nombre important de séquences disponibles représentent des avantages considérables (Jany et Barbier, 2008). Les gènes bactériens codant pour l’ARNr 16S contiennent 9 régions hypervariables V1–V9, dont la diversité de séquence diffère de manière importante selon l’espèce (Baker et coll., 2003). Ces régions hypervariables, contiennent également des régions très conservées, ce qui permet à la fois leur utilisation comme cible pour des amorces spécifiques ou universelles. Ces gènes sont donc utilisés à la fois pour l’identification spécifiques d’espèces et pour l’évaluation globale de la diversité de l’écosystème. La région hypervariable V3 est souvent utilisée comme cible, mais l’utilisation d’amorces ciblant d’autres régions peut améliorer l’analyse (Delbes et coll., 2007). L’analyse de l’ARNr chez les levures limite leur identification au genre ou à la famille (Jany et Barbier, 2008). L’utilisation des régions ITS (Internal Transcribed Spacers) permet une meilleure séparation taxonomique des levures d’un écosystème (Jany et Barbier, 2008). Un diagramme récapitulatif des différentes approches moléculaires pouvant être utilisées pour l’étude d’un écosystème microbien est représenté dans la figure 4. De plus, le tableau 4 résume les différentes approches culture-indépendante réalisées dans le fromage.
Figure 4 : Diagramme des différentes approches moléculaires permettant d’évaluer la
diversité génétique des communautés microbiennes (d’après (Dorigo et coll., 2005)
Échantillon naturel
Méthodes basées sur la PCR
(Extraction ADN total) Méthodes non basées sur la PCR Amplification par PCR Fixation des cellules
Hybridation avec des sondes nucléiques Clonage
Digestion enzymatique Séquençage Analyse par
fluorescence
Séparation par électrophorèse
Comptage par microscopie Analyse par cytométrie en flux Séquençage
aléatoire dans
DGGE : Denaturating Gradient Gel Electrophoresis ; TGGE: Temperature Gradient Gel Electrophoresis; (A)-RISA:(Automated)-Ribosomal IntergenicSpacer Analysis; SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism ; AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism; (T)- RLFP : Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism ; ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis; (TSA)-FISH: (Tyramide Signal Amplification)- Fluorescent In Situ Hybridization; FCM: Flow Cytometry.
une banque de clones PCR en temps réel DGGE/TGGE RISA/A-RISA SSCP/AFLP RFLP T-RFLP ARDRA FISH TSA-FISH FCM Séparation par électrophorèse Échantillon naturel
Méthodes basées sur la PCR
(Extraction ADN total) Méthodes non basées sur la PCR Amplification par PCR Fixation des cellules
Hybridation avec des sondes nucléiques Clonage
Digestion enzymatique Séquençage Analyse par
fluorescence
Séparation par électrophorèse
Comptage par microscopie Analyse par cytométrie en flux Séquençage aléatoire dans ne banque de clones PCR en temps réel DGGE/TGGE RISA/A-RISA SSCP/AFLP RFLP T-RFLP ARDRA FISH TSA-FISH FCM Séparation par électrophorèse u
Tableau 4 : Méthodes de culture-indépendante utilisées dans différentes études d’analyse des communautés microbiennes dans les fromages (d’après (Jany et Barbier, 2008).
Auteurs Utilisation Méthode Séquence ciblée Substrat
(Andrighetto et
coll., 2004) Évaluation de la diversité bactérienne • PCR-TTGE
Région V3 de l'ARNr 16S
Lactosérum de différent fromage de type Grana Padano
(Callon et coll., 2006)
Évaluation de la diversité des levures et de leur dynamique durant l'affinage du fromage/ Création d'une base de données des profils SSCP des levures
• SSCP-PCR Région V4 de l'ARNr 28S Fromage au lait cru (Salers)
(Cocolin et coll.,
2004) Protocole d’optimisation du profile bactérien • PCR-DGGE
Région V1 de l'ARNr 16S
Fromages frais et affinés (Cottage, Kefalotiri, Hallumi, Stracchino and Mozzarella)
(Cocolin et coll.,
2007) Détection de Clostridium spp. • PCR-DGGE
Région V1 de l'ARNr 16S
Fromage à défaut (Grana Padano)
(Coppola et coll., 2001)
Évaluation de la diversité bactérienne/ Discrimination entre les fromages traditionnels et industriels
• PCR-DGGE Région V3 de l'ARNr 16S Fromage artisanal et industriel non affiné (Pasta Filata)
(Coppola et coll., 2006)
Évaluation de la diversité et de la dynamique bactérienne au cours de la fabrication du
fromage • PCR-DGGE
Région V3 de l'ARNr
16S Fromage artisanal non affiné (Pasta Filata)
(Delbes et Montel, 2005)
Évaluation de la structure et la dynamique de la population de Staphylococcus au cours de
la fabrication du fromage • SSCP-PCR
Région V2 de l'ARNr
16S Fromages artisanaux au lait de cru • SSCP-PCR
(Delbes et coll.,
2007) Évaluation de la structure et de la dynamique de la communauté bactérienne • Banque de clone
Région V3 de l'ARNr
16S Saint-Nectaire artisanal et échantillons de lait cru • SSCP-PCR
(Duthoit et coll., 2005)
Évaluation de la diversité, de la dynamique
et de l'activité de la communauté bactérienne • SSCP-RT-PCR
Région V3 de l'ARNr
16S Fromage au lait cru (Salers) • SSCP-PCR
(Duthoit et coll., 2005)
Mise en relation de la diversité, la dynamique et l'activité de la communauté bactérienne avec les propriétés sensorielles
du fromage • SSCP-RT-PCR
Régions V2 et V3 de
l'ARNr 16S Fromage au lait cru (Salers)
• SSCP-PCR (Duthoit et coll.,
2003)
Évaluation de la diversité et de la dynamique
de la communauté bactérienne • Banque de clone
Régions V2 et V3 de
l'ARNr 16S Fromage au lait cru (Salers) • PCR-TTGE
• PCR-DGGE (El-Baradei et
coll., 2007)
Évaluation de la diversité de la communauté
bactérienne • Banque de clone
Région V3 de l'ARNr
16S et divers loci Fromage artisanal (Domiati)
(Ercolini et coll.,
2004) Évaluation de la diversité et de la dynamique de la communauté bactérienne • PCR-DGGE fingerprinting Région V3 de l'ARNr 16S
Lactosérum utilisé pour la fabrication de la Mozzarella traditionnelle de buffle • PCR-DGGE • DHPLC (Ercolini et coll., 2008)
Évaluation de la diversité microbienne du lactosérum du fromage AOC Caciocavallo
Silano • RAPD-PCR
Région V3 de l'ARNr 16S
Lactosérum utilisé pour la fabrication du Caciocavallo Silano
(Ercolini et coll., 2001)
Évaluation de la diversité et de la dynamique
de la communauté bactérienne • PCR-DGGE
Région V3 de l'ARNr 16S
Lactosérum utilisé pour la fabrication de la Mozzarella traditionnelle de buffle (Ercolini et coll.,
2002) Évaluation de l'analyse par PCR-DGGE • PCR-DGGE
Région V3 de l'ARNr 16S Fromages achetés de différents supermarchés • PCR-DGGE (Ercolini et coll., 2003)
Évaluation de la diversité de la communauté
bactérienne et localisation des populations • FISH
Régions V3 et V4–V5 de
• SSCP-PCR (Feurer et coll.,
2004b)
Évaluation de la diversité et de la dynamique
de la communauté bactérienne • Banque de clone
Région V3 de l'ARNr 16S
Fromage Français à pâte molle, fabriqué à partir de lait de vache pasteurisé • SSCP-PCR
(Feurer et coll.,
2004a) Comparaison de la diversité bactérienne entre un fromage traditionnel et industriel • Banque de clone
Région V3 de l'ARNr 16S
Fromage Français à pâte molle d'origine artisanale ou industrielle fabriqué à partir de lait de vache
(Flórez et Mayo, 2006)
Évaluation de la diversité et de la dynamique
de la communauté bactérienne et fongique • PCR-DGGE
Région V3 de l'ARNr 16S et la région D1 de
l'ARNr 26S Cabrales (Le Bourhis et
coll., 2005) Évaluation de la diversité de population de Clostridium • PCR-TTGE Région V5–V6 de l'ARNr 16S Fromages du commerce (Le Bourhis et
coll., 2007)
Évaluation de la dynamique de population de
Clostridium • PCR-TTGE
Région V5–V6 de
l'ARNr 16S Fromages expérimentaux (Mauriello et
coll., 2003)
Évaluation de la diversité de la communauté
bactérienne • PCR-DGGE Région V3 de l'ARNr 16S Lactosérum provenant de 2 localités de production de la Mozzarella (Mounier et coll.,
2009) Évaluation de la diversité microbienne à la surface du Livarot
• FISH • SSCP • Banque de clone Région V3 de l'ARNr 16S et la région D1/D2
de l'ARNr 26S Livarot commercial • PCR-DGGE
(Ogier et coll., 2004)
Évaluation de la diversité et localisation spatial des populations/ Création d'une base
de données des profiles bactériens. • PCR-TTGE
Région V3 de l'ARNr
16S 10 fromages du commerce (Ogier et coll.,
2002) Évaluation de la diversité de la communauté bactérienne • PCR-TTGE Région V3 de l'ARNr 16S Lait fermenté et fromages expérimentaux (Parayre et coll.,
2007)
Optimisation de l'extraction d'ADN et utilisation de la PCR-TTGE afin d'évaluer la
population bactérienne. • PCR-TTGE
Région V3 de l'ARNr
16S Emmental (Rademaker et
coll., 2005)
Évaluation de la diversité et de la dynamique
de la communauté bactérienne • T-RFLP ARNr 16S
Fromage expérimental (Tilsit)
(Randazzo et coll., 2006)
Évaluation de la diversité et de la dynamique de la communauté bactérienne au cours de la fabrication
• PCR-DGGE Région V6–V8 de l'ARNr 16S Fromage expérimental (Siciliano)
(Randazzo et coll., 2002)
Évaluation de la diversité, de la dynamique et de l'activité de la communauté bactérienne au cours de la fabrication
• PCR-DGGE (RT-PCR)
Régions V1-V3 et V6– V8 de l'ARNr 16S
Fromage artisanal de type Ragusano
(Saubusse et coll., 2007)
Étude des communautés bactériennes
capable d’inhiber Listeria monocytogenes • SSCP-PCR
Région V2 de l'ARNr 16S
Fromages fabriqués selon la technologie utilisée pour le Saint-Nectaire